Este protocolo fornece uma metodologia padronizada para o preparo e manuseio do tecido muscular em ambientes pré-clínicos e ensaios clínicos, o que é importante para obter resultados confiáveis no campo DMD. As técnicas são relevantes para testes de exon skipping para DMD. E a principal vantagem é que, eles são bem estabelecidos e reprodutíveis se realizados coletivamente.
Essas técnicas são focadas principalmente no exon skipping em DMD, mas com uma mudança de primers, as mesmas técnicas podem ser aplicadas a outras doenças tratadas com terapias de emenda. Esses métodos podem ser usados para alcançar a eficiência de exon skipping tanto quanto RNA e proteína. Para preparar uma amostra para análise, misture primeiro volumes iguais de goma e água até que a gengiva fique macia e pegajosa.
Coloque esta mistura em seringas de 25 mililitros e dispense 0,5 a um centímetro de goma em discos individuais de cortiça. Rotule os discos do lado oposto e coloque um recipiente de isopia em nitrogênio líquido até que parte do líquido congele. Coloque cada espécime na goma tragacanth nos discos com um eixo longitudinal de cada músculo perpendicular à rolha.
Coloque chiclete ao redor da parte inferior de cada músculo para ajudar a manter o músculo no lugar, e use pinças para congelar os espécimes na isopentane fria. Mova os espécimes continuamente por um minuto ou até que esteja completamente congelado antes de colocá-los temporariamente em gelo seco. Em seguida, coloque os espécimes em frascos de vidro para armazenamento de 80 graus Celsius.
Para seção do tecido muscular congelado para análise, defina um criostat para uma temperatura de trabalho de 25 graus Celsius, e para montar o bloco muscular no suporte. Corte o bloco de tecido até que as seções planas sejam alcançadas. Para análise de transcriptase reversa PCR e western blot, obtenha fatias de 10 micrômetros de espessura.
Para análise imunohistoquímica, obtenha fatias de seis a oito micrômetros de espessura, e para coloração de hematoxilina e eosina, obtenha fatias de 10 a 12 micrômetros de espessura. Após a aquisição, coloque as seções fatiadas em dois tubos mililitros. Armazene as amostras para PCR e manchas ocidentais a 80 graus Celsius.
Aqui, sistema de eletroforese de microchip, imagens em gel de reações de PCR de transcriptase reversa, e os resultados de sequenciamento da banda ignorada de dois pacientes antes e depois do tratamento com um oligonucleotídeo antissamparado em uma fase de escalonamento de dose fase um julgamento são mostrados. Ambos os pacientes abrigam exclusões. Como esperado, antes do tratamento, ambos os pacientes não mostraram falta e apenas uma banda não ignorada poderia ser visualizada.
Após 12 semanas de tratamento, uma faixa inferior clara foi visualizada para o segundo paciente, no entanto, ainda era difícil detectar qualquer produto ignorado para o primeiro paciente. Os resultados do sequenciamento mostraram uma concatenação dos exons 47 e 54 para o segundo paciente, e exons, 44 e 54 para o primeiro paciente. Para calcular a porcentagem ignorada, a concentração molar para a banda ignorada foi dividida pelas bandas puladas e não saltadas.
Como esperado, nenhuma banda de distrofina foi detectada pela mancha ocidental antes do tratamento. Após o tratamento, foi detectada uma faixa do segundo paciente com menor peso molecular em relação ao observado no controle saudável. O primeiro paciente, no entanto, não apresentou níveis detectáveis de distrofina após o tratamento.
É fundamental manusear o tecido muscular corretamente, e colocar cada espécime na gengiva tragacanth de forma consistente. As seções teciduais podem ser analisadas de várias maneiras diferentes, incluindo artificial para PCR, PCR digital, mancha ocidental, imunohistoquímica e com diferentes tipos de omics. Essas técnicas podem ser aceleradas, o desenvolvimento, exon adicional pulando drogas visando diferentes exons, e podem ser aplicadas ao desenvolvimento de baseados em virais e novamente na edição para DMD.
