A preparação de antibióticos fluorescentes permite avaliar a localização desses reagentes terapêuticos dentro das bactérias por meio de técnicas analíticas convenientes, como espectrofotometria e microscopia. A principal vantagem dessa técnica é a facilidade com que a localização do antibiótico pode ser determinada. Esta localização é relevante para uma série de fenômenos, incluindo o efflux.
Para realizar o clique Um procedimento de reação, coloque o antibiótico azida de interesse em um frasco fundo redondo e adicione 25 mililitros de tert-butanol e 25 mililitros de água por milidoso de azida ao frasco. Adicione o fluorohore alkyne preparado à solução e aqueça a reação a 50 graus Celsius. Em seguida, adicione 0,6 equivalentes de sulfato de cobre e 2,4 equivalentes de ácido ascórbico ao frasco.
Mexa a reação por uma hora ou até que a análise por LCMS indique a conclusão da reação. Em seguida, esfrie e purifique a reação conforme apropriado para o andaime antibiótico. Aqui, a reação química do clique chave para a preparação de antibióticos fluorescentes com exemplos da estrutura sintetizada a partir dos antibióticos correspondentes através de um intermediário azida à base de ciprofloxacina, linezolide e trimetoprim são mostrados.
Nestes traços de espectrometria de massa cromatografia líquida de um azida de ciprofloxacina e uma reação de clique de Alkyne NBD, o azida foi elucido em 3,2 minutos e o produto foi elucido em 3,8 minutos. O progresso da reação do clique pode ser seguido pelo desaparecimento do pico do azide. Nestes espectros, o impacto da purificação pode ser visualizado com picos errôneos desaparecendo.
Para avaliar a atividade antimicrobiana do antibiótico sintetizado, os estoques de glicerol de cepas bacterianas apropriadas para o andaime antibiótico em placas de ágar LB e crescem as culturas durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, escolha uma única colônia de cada prato e cultura as colônias durante a noite em cinco mililitros de CAMHB por cultura a 37 graus Celsius. No dia seguinte, diluir as culturas aproximadamente 40 vezes em CAMHB fresco e cultivar as bactérias para a fase de tronco médio com uma densidade óptica de 600 nanômetros entre 0,4 e 0,8.
Em seguida, prepare as soluções de estoque de cada antibiótico fluorescente a 1,28 miligramas por mililitro em sulfóxido de 20% de dimetila em água estéril e adicione 10 microliters de antibiótico a cada poço da primeira coluna de uma placa de 96 poços. Adicione 90 microliters de CAMHB a cada poço da primeira coluna e 50 microliters a todos os outros poços. Em seguida, realize uma diluição serial de duas vezes através da placa.
Após a mistura minuciosa, dilui as culturas da fase de tronco médio para aproximadamente uma vez 10 a sexta colônia formando unidades por mililitro e adicione 50 microliters de cada cultura aos poços de diluição para obter uma concentração final de aproximadamente cinco vezes 10 para a quinta colônia formando unidades por mililitro. Quando todas as bactérias tiverem sido banhadas, coloque as tampas nas placas e incuba as culturas por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius sem tremer. No dia seguinte, inspecione visualmente as placas.
A concentração mínima de inibição será a menor concentração sem crescimento visível. Para análise de acumulação de sondas, os estoques de glicerol de raia das cepas bacterianas em placas de ágar LB para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, escolha uma única colônia da placa para a cultura da noite para o dia em caldo de lysogeny a 37 graus Celsius.
Na manhã seguinte, diluir a cultura da noite para o dia aproximadamente 50 vezes em meio fresco. Quando a cultura atinge a fase de tronco médio, pelota as bactérias por centrifugação e decanta o meio. Resuspend a bactéria em um mililitro de PBS e centrifugar as bactérias novamente.
Decante o supernasce e resuspenda a pelota lavada em PBS para uma densidade óptica a 600 nanômetros de dois. Adicione 10,1 microliters de 10 mililitros CCCP em PBS a um mililitro de bactérias e incubar a bactéria a 37 graus Celsius por 10 minutos. Ao final da incubação, colete as bactérias por centrifugação e resuspenja a pelota em um mililitro de 10 a 100 micromolar solução de antibiótico fluorescente em PBS.
Depois de uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, lave as células por centrifugação quatro vezes em um mililitro de PBS frio por lavagem. Após a lavagem, lise as bactérias com 180 microliters de tampão de lise e 70 microliters de lysozyme. Após 30 minutos a 37 graus Celsius, congele a bactéria três vezes a menos 78 graus Celsius por cinco minutos e 34 graus Celsius por 15 minutos, respectivamente.
Após a última rodada de congelamento, sonicize a amostra por 20 minutos seguido de uma incubação de 30 minutos a 65 graus Celsius. Ao final da incubação, colete a amostra lísmida por centrifugação e coe o conteúdo do tubo através de uma membrana de filtro de 10 quilodalton. Lave o filtro quatro vezes com 100 microliters de água por lavagem e aliquot cada lavagem em poços individuais de uma placa de fundo liso preto de 96 poços.
Em seguida, meça a intensidade da fluorescência em um leitor de placas com comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados ao fluoróforo. Estes resultados típicos da avaliação do acúmulo intracelular por espectroscopia de fluorescência na presença e ausência de efflux mostram que a fluorescência intracelular da bactéria é significativamente maior após o pré-tratamento com CCCP indicando que o efflux reduz o acúmulo dentro da bactéria. Nestas imagens representativas de microscopia confocal de bactérias Gram positivas e Gram negativas, a localização do antibiótico dentro da bactéria pode ser visualizada após o tratamento do CCCP.
Este fenômeno não é observado quando nenhum CCCP é adicionado. Ao usar antibióticos fluorescentes, esteja atento às informações que você pretende coletar e certifique-se de considerar qual protocolo será mais útil na obtenção desses dados. Após sua síntese, antibióticos fluorescentes podem ser usados para estudar uma série de processos bacterianos, incluindo interações de alvos medicamentosos e modificações de resistência.
