Nosso protocolo fornece um processo claro para estudar os efeitos neuroviolíno das substâncias e os poluentes de interesse sobre larvas de zebrafish e para revelar a potencial neurotoxicidade desses agentes. A técnica pode ser realizada utilizando testes de alto rendimento de neurobehaviors no modelo zebrafish. Este método pode ser aplicado para avaliar efeitos alelo-neurobehaviorais de poluentes para demonstrar potencial neurotoxicidade em nós humanos, já que o genoma dos zebrafish tem uma alta homologia com humanos, por isso pode fornecer indicações para o manejo químico e os problemas de saúde pública causados por poluentes.
Como o zebrafish tem a vantagem da triagem de alto rendimento, este método fornece uma visão tanto do desenvolvimento de drogas psicotrópicas quanto da pesquisa toxicológica ambiental. Não se intimide em estudar o primeiro experimento. Se você seguir o protocolo, você terá um resultado bem sucedido.
Pelo menos duas horas antes de realizar um experimento, ajuste a temperatura ambiente para 28 graus Celsius e adicione 800 microliters de solução de exposição a cada poço de uma micropla placa de 48 poços. Em seguida, use uma pipeta de um mililitro com uma ponta modificada para transferir uma larva em 200 microliters de solução de exposição para cada poço da microplaca em preparação para um experimento de locomoção e ângulo de caminho. Para preparar uma microplacã de seis poços para experimentos de comportamento social, adicione quatro mililitros de solução de exposição a cada poço das seis microplacas do poço e transfira duas larvas em 200 microliters de solução de exposição para cada poço.
Antes de iniciar o teste, abra o programa de software de monitoramento de alto throughput e selecione o módulo de ângulos de caminho de rotações de rastreamento. Transfira a microplacão de 48 poços para a plataforma de gravação e puxe a tampa. Clique em Arquivo e Protocolo de Geração para começar a gerar um novo protocolo e digite 48 na posição de contagem de localização.
Clique em Parâmetros, Parâmetros de Protocolo e Tempo, defina a duração do experimento para uma hora e 10 minutos e o período de Integração para 60 segundos. Usando a ferramenta de forma elíptica, desenhe um círculo ao redor do canto superior esquerdo bem. Selecione o círculo e clique em Copiar, Marcar no Canto Superior Direito, Colar e Selecionar.
Use o mouse para arrastar o círculo copiado para o canto superior direito bem e clique em Copiar, Marcar no Canto Superior Direito, Colar e Selecionar novamente. Em seguida, arraste o círculo copiado para o canto inferior direito bem e clique em Construir e Limpar marcas. O sistema desenhará automaticamente um círculo sobre todos os outros poços da placa.
Em seguida, clique em Desenhar escala e desenhe uma linha de calibração na tela. Digite o comprimento da linha, defina a unidade e clique em Aplicar ao Grupo. Defina a cor animal como preta e defina o limiar de detecção para 16 a 18 para permitir a detecção dos animais, coloque o inativo a uma pequena velocidade para 0,5 centímetros por segundo e a pequena e grande velocidade a 2,5 centímetros por segundo.
Defina as classes de ângulo de caminho de menos 180 para mais 180, conforme indicado. Para definir as condições de luz, clique em Parâmetros, Condução da Luz, Use um dos 3 métodos de acionamento abaixo e estímulos aprimorados para definir as condições de luz. Clique em Edge e defina um período escuro de 10 minutos, seguido por três ciclos de alternação de 10 minutos de luz e períodos escuros.
Então, salve o protocolo. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, abaixe a iluminação na sala de teste e deixe as larvas se aclimatando no sistema por 10 minutos. No final do período de aclimatação, clique em Experimentar e Executar e criar a pasta na qual os arquivos experimentais devem ser salvos.
Em seguida, digite o nome do resultado e clique em Plano de Fundo e Iniciar. No final do experimento, clique em Experimentar e Parar. Em seguida, devolva a microplaca de 48 poços de volta à incubadora de luz para experimentos subsequentes.
Como cada grupo pode incluir 16 animais, o sistema pode ser usado para realizar testes de alto rendimento da locomoção e ângulo de caminho em diferentes condições de tratamento em uma única microplaca de 48 poços. A atividade social das larvas pode ser testada usando placas de seis poços. Neste experimento representativo, o grupo de maior concentração de BDE-47 demonstrou hipoatividade pronunciada durante o período escuro, enquanto não foram observadas alterações devido à exposição ao BDE-47 durante os períodos de luz.
Além disso, o grupo de alta concentração de 6-hidroxi-BDE-47 realizou menos curvas de rotina e média em cinco dias após a fertilização. No entanto, curvas mais responsivas foram induzidas nos grupos de exposição 6-metoxi-BDE47. A atividade social do zebrafish foi estimulada pela parafina clorada-70 e pela parafina clorada de cadeia curta-52b, enquanto a parafina clorada de cadeia longa-52a encurtou a duração para o contato das larvas.
É importante ter certeza de que as larvas transferidas para o teste devem ter uma habilidade normal de natação e sem malformações. Outras variáveis, como preferência de cor, preferência clara-escura, toda escuridão, movimentos de cauda de zebrafish, podem ser incluídas para responder a perguntas adicionais sobre toxicidade neuroviolenta de poluentes ambientais. As soluções de exposição BDE-47 são neurotóxias e têm potencial de ruptura endócrina, por isso não deixe de evitar o contato direto com a pele.
