Este protocolo visa imitar o cenário clínico da doença residual após a cirurgia de desesbulação do tumor e, portanto, permite testar novas terapias cancerígenas no contexto da cicatrização de feridas pós-operatórias. A vantagem dessa técnica é que ela permite a padronização da quantidade de ferida infligida e a quantidade de tumor para permanecer. Esta técnica é particularmente importante para estudos pré-clínicos na identificação de novos tratamentos para cânceres, que recaí-lo localmente um exemplo de que é sarcoma de tecido mole.
Essa demonstração visual é fundamental para demonstrar a técnica de inversão, que nos permite expor o tumor ligado ao lado da pele. Inicie este procedimento com a inoculação subcutânea de células cancerígenas preparadas em camundongos, conforme descrito no protocolo de texto. No dia 12, pós-inoculação, quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 50 milímetros quadrados, dose de camundongos com 100 microliters de buprenorfina subcutânea no pescoço, 30 minutos antes da cirurgia.
Configure a área cirúrgica com a almofada de calor coberta com casaco de banco e configure um cone de nariz para anestesia. Disponha equipamentos cirúrgicos limpos para que estejam de fácil acesso, incluindo clorhexadina, cotonete, gaze, gel ocular, duas fórceps curvas, tesoura, aplicador de clipe, removedor de clipes e recargas de clipe. Aqueça a câmara de aquecimento a 37 graus Celsius e configure outra almofada de aquecimento para recuperação.
Note que este procedimento requer duas pessoas. Um assistente deve monitorar a respiração do mouse de perto durante o procedimento. Depois de anestesiar o mouse como descrito no protocolo de texto, realize um teste de pinça e teste de reflexo córnea para garantir que o rato esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.
Cubra os olhos do rato com uma pequena quantidade de gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos. Comece esta cirurgia limpando a área cirúrgica com clorhexadina. Usando fórceps e um par de tesouras fazem uma incisão reta de um centímetro ao longo do lado dorsal, a três milímetros do tumor.
Não corte a pele diretamente cobrindo o tumor, pois ele não vai curar bem. Evite usar um bisturi para cortar o tumor e use pinças para colher os pedaços. Usando pinças, retire a fáscia e o tecido gorduroso subcutâneo entre o tumor e o peritônio.
O tumor subcutâneo é normalmente ligado ao lado da pele. Abra a ferida segurando suavemente a pele no lado do rolamento do tumor usando pinças e inverta o tumor para que ele fique visível lá fora. Usando um par de tesouras, corte a cápsula tumoral da metade para remover, começando da base do tumor mais próximo da abertura.
Para cirurgia de 50%, corte no meio do tumor. Usando fórceps curvas, retire a seção do tumor para ser removida. Pegue qualquer remanescente da área de debulk.
Para 75% debulk, comece realizando um debulk tumoral de 50%, depois corte pela metade os 50% restantes do tumor. Pegue 25% do tumor usando fórceps curvos. Para fechar o local cirúrgico, coloque o tumor restante de volta sob a pele e usando fórceps, puxe os retalhos da pele e forra a pele ao longo da ferida.
Segure a pele a cinco milímetros da borda da ferida e use clipes cirúrgicos para fechar a ferida começando ao lado, mais perto dos fórceps. Aplique quantos clipes for necessário para garantir que nenhum tecido subjacente seja exposto. Geralmente, três a quatro clipes são aplicados com intervalos de dois milímetros entre os clipes.
Permita que os ratos se recuperem colocando-os na câmara de aquecimento quente. Coloque a gaiola do mouse na almofada de calor. Monitore os ratos na câmara de aquecimento até que se recuperem do anestésico.
Em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola, deixe a gaiola na almofada de calor por mais 10 minutos até que os ratos se tornem mais ativos. Dê aos ratos comida molhada e macia. Monitore os ratos uma hora após a cirurgia para recuperação.
Monitore os ratos novamente no final do dia e na manhã seguinte e garanta que os clipes permaneçam no lugar. Trate camundongos perioperativamente com advento ou terapia neoadjuvante a qualquer momento, dependendo do tratamento de interesse. Por exemplo, trate camundongos com uma dose de 100 microgramas de anti-CTLA-4 intraperitonealmente no dia 15 após a inoculação.
Alternativamente, trate os camundongos com três doses de 200 microgramas de anti-PD-1 intraperitonealmente nos dias, 15, 17 e 19 após a inoculação. A ressecção cirúrgica incompleta de 50 tumores quadrados, indicado aqui pela linha pontilhada resulta em recrescimento 100% reprodutível dos tumores na ausência de imunoterapia adjuvante. Portanto, o crescimento do tumor para um tamanho de 50 milímetros quadrados é um tamanho ideal para debulk parcial.
O modelo foi então usado para testar imunoterápicos adjuvantes usando anticorpos contra módulos de ponto de verificação, proteína associada ao linfócito T citotóxico quatro e receptor de morte programado um. Tratamento de camundongos com anti-CTLA-4, resultou em uma taxa de cura de 80%Enquanto o tratamento de camundongos com anti-PD-1 resultou em uma taxa de cura de 25% A resposta com anti-PD-1 fornece uma oportunidade de testá-lo novas combinações, para melhorar ainda mais a taxa de resposta. É importante que o tumor restante permaneça ligado à pele, caso contrário o suprimento sanguíneo será cortado e o tumor se tornará o necrosado.
Após esse procedimento, os tumores podem ser analisados por uma variedade de métodos, como a citometria de fluxo, a fim de avaliar como a cirurgia afeta as células infiltradas de tumores. Este modelo de camundongos nos permitiu explorar como a cicatrização de feridas afeta as imunoterapias cancerígenas.
