Células da linha celular SW1353 condrossarcoma foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr. PCW Hogendoorn e Prof Dr. J. Bovée Universidade de Leiden, na Holanda. Agradecemos J. Mestach e G. Wagemans para uma excelente assistência técnica, e G. De Bruyne para o desenho profissional do panorama do nosso protocolo.

Veja a Figura 1 para uma visão geral Material tumoral 1. Obtenção e preparação de amostras de tumor Para a utilização do material do paciente, é necessária a aprovação do Comité de Ética e consentimento informado tem de ser obtida a partir do paciente. <ol><li> Colheita de material representativo (mínimo de 1 cm 3), no momento da intervenção, ou de uma biópsia ou uma ressecção de um sarcoma. O próprio site da biópsia é definida usando dinâmico de contraste MRI. </li><li> Colocar imediatamente o material num frasco estéril contendo meio DMEM suplementado com 1,000 U de penicilina e 1 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Transportar o frasco imediatamente (30 - 90 min), para o laboratório. </li></ol> Todos os seguintes procedimentos são realizados sob fluxo laminar. <ol start="4"><li> Verter o conteúdo do frasco para uma placa de Petri esterilizada. </li><li> Coloque a amostra de tumor em pequenas partes do máximo 1 m3 m utilizando um bisturi esterilizado. Remover todas as partes calcificadas pois tendem a diminuir ainda mais o processamento do tecido. </li><li> Aleatoriamente levar 10 enxertos tumorais para aplicação no CAM. </li></ol> 2. Preparação de suspensões de células derivadas de tumor individuais Duração aproximada: 3 horas <ol><li> Pesa-se o tecido remanescente da amostra. </li><li> Colocar 2-4 gramas de tecido num tubo dissociador, mais do que um tubo pode ser necessária para digerir todo o tecido do tumor remanescente. </li><li> Para a digestão de 2-4 g de tecido, adicionar 2,5 ml de solução de colagenase 2 (500 U / ml de meio RPMI 1640) e uma solução de 2,5 ml de ADNase (22 KU / ml de RPMI 1640). </li><li> Processar o tecido de acordo com o protocolo h_tumor dissociador. Isto envolve dois ciclos de incubação a 37 ° C na incubadora de CO 2, enquanto o tubo é suavemente agitada durante 30 min. </li><li> Filtrar a suspensão restante através de um filtro de células 150 mM. </li><li> Centrifuga-se o ligado a 1000 rpm, durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão de lise de eritrócitos (BLI), permitindo que os 10 minutos de incubação com a suspensão regular. </li></ol> Nota: tampão de lise dos eritrócitos é fabricada como se segue: Adicionar 0,037 g de EDTA, 0,99 g de K 2 HPO 4, 8,29 g de NH 4 Cl a 1.000 ml de água, o uso de NaOH 10 N para ajustar o pH para 7,3, filtro sob pressão através de um 0,22 filtrar. Armazenar a 4 ° C. <ol start="9"><li> Adicionar 25 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina) para parar a reacção. </li><li> Centrifugar a suspensão a 1000 rpm durante 5 min. A cor da pastilha deve ser branco agora. </li><li> Remover o sobrenadante. </li><li> Adicionam-se 5 ml de meio ao sedimento. Filtrar a suspensão através de um filtro de 70 | iM de células. </li><li> Conte o número de células vivas / ml por meio de um contador de células automático. </li></ol> 3. CLinhas Celulares Ancer SAOS2 células de osteosarcoma (número ATCC: HTB-85) que expressam a proteína fluorescente verde melhorada foram electroporadas com vector pEGFP-C1 usando a linha celular Kit Nucleofector V de acordo com o protocolo do fabricante. Para estabelecer linhas celulares estáveis, as células transfectadas foram seleccionadas em G418 (1 mg / ml), durante 4 semanas, em conformidade com o protocolo estabelecido anterior 20. Além disso, a triagem foi realizada por triagem de células activadas por fluorescência (FACS) de acordo com as instruções do fabricante. Células da linha de células de condrossarcoma de SW1353 (número ATCC: HTB-94) ou de tumores recentemente preparadas suspensões de células únicas são rotulados usando uma membrana lipofílico fluorescente mancha vermelha. <ol><li> Remover as células do frasco de cultura de um modo clássico utilizando tripsina (0,5% p / v) de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0,2% p / vol) de solução. </li><li> Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 1000 rpm. </li><li> Remover o supernatant. </li><li> Adicionar 1 ml de meio isento de soro, e 5 ul de DII (Vybrant vermelho) / 10 6 células. </li><li> Embrulhe o frasco em papel alumínio e coloque-o na incubadora de CO 2 por 10 min a 37 ° C. </li><li> Centrifugar novamente durante 5 min a 1000 rpm e remover o sobrenadante. </li></ol> Ensaio membrana Corioalantóide 1. Incubação dos ovos <ol><li> Ovos fertilizados de uma incubadora comercial local, garantindo 95% de fertilização dos ovos são obrigatórios. </li><li> Os ovos fertilizados podem ser armazenadas à temperatura ambiente até 10 dias. </li></ol> Nota: antes de iniciar a incubação, sujidade, penas e excrementos são cuidadosamente removidos das cascas mecanicamente por limpeza a seco com toalhas de papel, que possuem uma áspera ao invés de uma estrutura de superfície macia. Limpar os ovos com 70% de etanol desnaturado ou de qualquer outro reagente de limpeza reduz significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões de galinha. <ol start="3"><li> Coloque os ovos na incubador de um lado, a marcação da superfície superior. O dia em que os ovos são colocados na incubadora é designado 0 dias do desenvolvimento embrionário. </li><li> Ajustar a temperatura de incubação a 37,8 ° C e a humidade de 47%. Certifique-se que a opção de rotação automática está desligado. </li></ol> 2. Abertura dos Ovos Duração: 60 min ± 25 para ovos No desenvolvimento dia 3, os ovos estão abertos com fluxo de ar laminar. Abrindo os ovos em um desenvolvimento mais resultados do estágio em danos para o CAM, como a membrana tende a ficar com o shell. Uma lâmpada de infravermelhos é usado para manter os ovos quentes durante o procedimento. Para melhorar a esterilidade, recomendamos o uso de luvas de mão. <ol><li> Coloque o ovo na eggcup, com o lado virado para cima acentuado. </li><li> Diminuir o nível da CAM removendo dois ml de albumina através de uma agulha G 18 inserido na extremidade do ovo. Se a agulha estiver fechado após perfurar várioscascas de ovos, substitua a agulha. Se não, muita força tem de ser exercida, o que resulta em danos para a gema de ovo ou fractura do reservatório. Por vezes, a agulha é bloqueada pelo chalazae, uma das duas bandas em espiral para a suspensão da gema de albúmen. Isto pode ser resolvido empurrando suavemente o êmbolo para baixo até que o bloco seja resolvido. Se a gema de ovo é aspirado para dentro da seringa, substituir a agulha, bem como a seringa. Por vezes, o embrião morre após este evento. Se uma quantidade insuficiente de albúmen é removido, o CAM será danificado quando o invólucro é retirado. </li><li> Aplicar uma camada adesiva semi-permeável, no lado superior do reservatório marcada, a fim de evitar o derramamento de partículas de casca sobre a CAM durante o corte da janela. </li><li> Fazer um buraco com a introdução de um pequeno furador na superfície do ovo. </li><li> Corte uma janela de 1 cm 2 no shell, usando um par de tesouras cirúrgicas estéreis pontiagudo. </li><li> Pulsante coração do embrião e vasos adjacentes podem ser observados no the superfície da gema de ovo. Retire os ovos não fertilizados ou embriões mortos. Um aspecto interrompido dos vasos sanguíneos caracteriza embriões mortos. </li><li> Selar a janela com uma película adesiva semipermeável. Não é necessário para cobrir o local da punção, a menos que a casca rachou durante a inserção da agulha. </li></ol> 3. Procedimento de Inoculação Duração: ± 1 hora por linha celular Em garota desenvolvimento embrionário dia 9, os ovos são inoculados sob fluxo de ar laminar. Avaliação da célula cancerosa espalhando pela CAM requer confinamento das células para uma superfície limitada durante a inoculação. Matrigel é uma matriz de (ECM) em gel extracelular do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm frequentemente utilizados em condições de cultura de células experimentais. É um líquido, quando arrefecida, mas irão sofrer polimerização activado termicamente, quando trazida a 20 - 40 ° C, formando, assim, um gel estável. Duranteos experimentos, Matrigel é mantido em uma caixa contendo o derretimento do gelo. Nota: Nós insistimos em não usar lamelas perfuradas. Observou-se ligação e crescimento de células cancerosas enxertadas sobre o disco plástico, assim, o potencial de polarização das células na própria membrana crescimento. <ol><li> Ressuspender a pelota de células em gel de ECM arrefecido a uma concentração de 10 6 células/100 ul de gel de ECM. Manter esta solução em gelo derretido. </li><li> Impostos parte da membrana semi-permeável com um par de cirurgia estéril sob fluxo laminar. Se a película de adesivo é removido completamente, isto irá resultar em uma proporção maior de morte do embrião devido à contaminação. </li><li> Toque a direita CAM abaixo da janela do escudo levemente com uma vareta de vidro esterilizada, para remover a camada de células epiteliais. Tocando a CAM com uma vareta de vidro esterilizada prova ser menos traumático do que usando um bisturi n ° 11, o que requer mais maneabilidade e experiência. Podem ocorrer pequenas hemorragias. </li><li> Adding material tumoral. </li><li> Para enxertos tumorais: abaixe um pedaço de tecido sobre a CAM com um par de pinças estéreis, sem apertar. </li><li> Para o procedimento de gel de ECM: 4x Adicionar 25 ul da suspensão de gel de célula-ECM para o CAM, em cima umas das outras, permitindo que o gel de ECM para polimerizar entre as aplicações. Desta forma, uma placa aderente contendo as células do cancro é criado. </li><li> Selar a janela do shell novamente com uma película adesiva semipermeável. </li></ol> 4. Imagem e colheita do CAM Duração: 2 horas para 25 ovos Em garota desenvolvimento embrionário dia 16, os CAMs são colhidas. Trabalhando sob fluxo de ar laminar não é necessário. <ol><li> Ampliar a janela com um par de tesouras cirúrgicas. Certifique-se de não cortar muito baixo, caso contrário, o CAM será danificado, resultando em sangramento dos vasos lesados. </li><li> Adicionar 300-500 mL de PBS D com uma pipeta na seita CAMiões contendo o material inoculado. Se não forem utilizadas sondas fluorescentes, tamponado pode ser utilizado como o que torna a membrana mais rígida, o que facilita o corte da membrana. </li><li> Adicione uma fotografia da CAM no ovo através de um microscópio de fluorescência estéreo, equipado com uma câmara de cor digital, usando tanto o GFP ou o filtro de DSR e nenhum filtro. Para os enxertos tumorais, todas as fotografias são feitas sem filtros. Iluminação de cima por luzes LED é fortemente recomendado durante a fotografar (Figura 2). </li><li> Migração de células tumorais recorde de células marcadas. As bordas dos tumores pode ser irregular e desgastado. Células dispersas podem estar presentes perto das fronteiras do tumor. Em alguns casos, contudo as linhas de células de tumor pode ser observado (Figura 3). </li><li> Cortar a membrana com um par de tesouras estéreis na fronteira deitado contra a casca. </li><li> Coloque a CAM colhidas numa placa de Petri estéril cheio com PBS D ou tamponada paraformaldeído. </li><li> Adicione uma fotografia de tanto do lado superior e do lado inferior da CAM, ambos com e sem o filtro. </li><li> Colocar a membrana em um recipiente rotulado com formol tamponado durante pelo menos 72 horas. </li><li> Incorporar os CAMs em parafina e prepará-los para exame histológico. Ter o cuidado de cortar os enxertos de tumor no centro do nódulo, certificando-se a superfície de corte é paralela à parte inferior da cassete. Se não, a interacção entre o CAM e o enxerto do tumor não será visível. A mesma estratégia aplica-se às placas de gel de ECM: a superfície voltada para a lâmina de corte deve ser perpendicular à placa. </li></ol> 5. A avaliação histológica Hematoxilina-Eosina e Ki-67 imuno-histoquímica foram realizados para maiores esclarecimentos, se necessário. A imuno-histoquímica foi realizada em secções de tecido embebidas em parafina fixados com formaldeído 3,5 um de espessura, utilizando um corante corrediça automatizado de acordocom as instruções do fabricante. Foi utilizado um anticorpo monoclonal de ratinho primário para o Ki-67 (clone MIB-1, diluição de 1/100). Induzida pelo calor epitopo recuperação foi realizado utilizando células Condicionamento 1, ea visualização foi realizada com o Kit de Detecção de DAB universal, de acordo com as instruções do fabricante. Desidratação de as secções de tecido foi realizada utilizando um coverslipper automatizado. Para o SAOS2 e as linhas de células SW1353, o número de células Ki67-positivas e-negativas Ki67 nuclei/100 mM 2 foram contadas em três zonas: uma perto da fronteira do CAM, uma perto da superfície e um no centro do a placa de gel de ECM. Este procedimento foi repetido para cada lâmina 6x Ki-67 coradas. O índice de proliferação foi determinada para cada lâmina, dividindo o número de células Ki67-positivas pelo número total de células contadas. A necrose é definida por uma perda de dispersão fina da cromatina no núcleo da célula, acompanhado por fading de margens das células distintas. Para xenotransplantes, a necrose é pontuado como completa, parcial (muitas vezes à superfície), ou está ausente. A infiltração de células de tumor na CAM é definida pela observação de células tumorais dentro da mesoderme da CAM, e é marcado como estando presente ou ausente. Três itens são marcados para o comportamento host. Infiltração de fibroblastos é definido como células alongadas deixando a CAM e invadir o enxerto / placa do tumor, e é marcado como estando presente ou ausente. Crescimento interno vascular pode ser observado como o crescimento interno de proliferação de vasos pintainho, caracterizados pela presença de eritrócitos nucleados do pintainho.

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Os autores não têm nada a revelar.

Momento da inoculação e da colheita Temporizando no dia da inoculação foi realizada utilizando gel de SAOS2 em ECM (CAMs 36) e variou entre o dia de desenvolvimento embrionário 5 e 10. Antes da incubação dia 9, o CAM não foi consistentemente grande o suficiente para suportar o gel ECM foi aplicado. Na colheita, as células tumorais, por vezes, tinha de ser recuperado do CAM mais profunda, e algumas amostras de gel ECM estavam mentindo solta no albúmen ou no...

Sarcoma é um tumor raro do tecido conjuntivo com uma elevada mortalidade devido à resistência à terapia 1,2. O progresso na sobrevida do paciente é dificultada pela sua baixa incidência anual, sua ampla diversidade, eo fato de que as células do sarcoma são relatados para ser difícil de cultura in vitro 3,4. A utilização de células de cultura para a avaliação pré-clínica terapêutica revelou que novas moléculas, aparentemente activos in vitro nem sempre reflectem os resultados na prática clínica. Além disso, as aberrações genoma reveladas por matrizes de expressão de genes nem sempre são correlacionados às características do comportamento do tumor no doente 5-7. A fim de tentar resolver estes problemas, a medicina personalizada ganhou em importância, o que se reflete no aumento da procura de modelos de xenoenxerto 8-12. Um ensaio in vivo tem a vantagem de refletir a complexa interação entre cAncer células e para o ambiente de tecido do hospedeiro em tumores sólidos, necessários para a proliferação e invasão de 13 cancro. Atualmente, estudar o uso do ensaio de membrana cório-alantóide (CAM-ensaio) como um modelo de xenoenxerto reprodutível para sarcoma 14,15. Este teste é amplamente usado para o estudo da angiogénese tumoral 16,17. Na literatura, no entanto, encontrámos protocolos diferentes para este ensaio, enquanto que outros estudos observada uma marcada diferença no crescimento ou angiogénese de acordo com diferentes protocolos de 18,19. Neste artigo, foi investigado o efeito da variação das condições do ensaio de CAM, no comportamento de células de tumor, utilizando enxertos de suspensões de células únicas derivadas de tumor e culturas de células de sarcoma estabelecidos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

Sarcoma é uma doença muito rara, que é de natureza heterogénea, toda a impedir o desenvolvimento de novas terapias. Pacientes com sarcoma são candidatos ideais para a medicina personalizada após estratificação, explicando o interesse atual no desenvolvimento de um modelo de xenotransplante reprodutível e de baixo custo para esta doença. A membrana corioalantóide garota é uma série imunodeficientes natural, capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições específicas de cada espécie. Além disso, é facilmente acedido, manipulados e fotografada usando estereomicroscopia óptica e fluorescência. Histologia permite análise mais detalhada das interações celulares heterotípicos. Este protocolo descreve em pormenor o enxerto in ovo da membrana corioalantóica com sarcoma derivados de tecidos frescos de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes (Saos-2 e SW1353). O rato sobrevivência garotaes são de até 75%. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento. Para localizada enxertia de suspensões de células individuais, de ECM de gel proporciona vantagens significativas em relação aos materiais de contenção inertes. O índice de proliferação Ki67 está relacionada com a distância entre as células da superfície da CAM e a duração da aplicação no CAM, este último determina um período de tempo para a adição de produtos terapêuticos.

Avaliação da CAM Enxertos de tumor se tornar aderente à CAM (Figura 2A). As suspensões de células únicas de material paciente frequentemente exibir uma seco, a placa ligeiramente levantada (Figura 2D). Após a excisão da CAM, marcado enrugamento da membrana ocorre (figuras 2E e 2F). Para as linhas celulares comerciais da placa torna-se mais opaca com o tempo, indicando a proliferação de cé...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

O<em&gt; In ovo</em&gt; Membrana corioalantóica (CAM) está enxertado com sarcoma de tecidos frescos derivadas de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento.

O<em&gt; Em ovo</em&gt; CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.3K visualizações.  Ghent University Hospital. O In ovo Membrana corioalantóica (CAM) está enxertado com sarcoma de tecidos frescos derivadas de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

A estratégia para identificar mutações de novo em Distúrbios comuns, tais como autismo e esquizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Medicina

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Um método simples parafuso Guia para intracraniana Estudos Xenoenxerto em Ratos

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and diabetic retinopathy. It was the object of this study to introduce a standardized stress model for future preclinical therapeutic testing.
Bovine retinas were prepared and perfused with an oxygen saturated standard solution, and the ERG was recorded. After recording stable b-waves, hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;m glutamate) was exerted for 45 min. To investigate the effects on photoreceptor function alone, 1 mM aspartate was added to obtain a-waves. ERG-recovery was monitored for 75 min.
For hypoxia, a decrease in a-wave amplitude of 87.0% was noted (p &#60;0.01) after an exposition time of 45 min (decrease of 36.5% after the end of the washout p = 0.03). Additionally, an initial decrease in b-wave amplitudes of 87.23% was recorded, that reached statistical significance (p &#60;0.01, decrease of 25.5% at the end of the washout, p = 0.03).
For 250 &#181;m glutamate, an initial 7.8% reduction of a-wave amplitudes (p &#62;0.05) followed by a reduction of 1.9% (p &#62;0.05). A reduction of 83.7% of b-wave amplitudes (p &#60;0.01) was noted; after a washout of 75 min the reduction was 2.3% (p = 0.62). In this study, a standardized stress model is presented that may be useful to identify possible neuroprotective effects in the future.

With this study, we introduce a standardized stress model for the isolated superfused bovine retina for future preclinical therapeutic testing. The effect of either hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;M glutamate) on retinal function represented by a- and b-wave amplitudes was evaluated.

Glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

o<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Corioalantóide membrana (CAM) como um Ensaio Xenoenxerto modelo eficiente de carcinoma hepatocelular

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Ácido oleico-injeção nos suínos como um modelo para a síndrome respiratória aguda

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...