Este protocolo demonstrará como células-tronco pluripotentes induzidas diferenciadas podem ser semeadas em um órgão-on-chip para gerar uma barreira hematoencefálica totalmente humana, personalizada e microfluidica, que pode ser usada para prever a permeabilidade do sistema nervoso central e estudar distúrbios neurológicos. Usando um órgão-on-chip comercialmente disponível, vamos demonstrar como qualquer laboratório biologicamente orientado pode usar essa tecnologia para gerar uma barreira sangue-cérebro-cérebro personalizada e microfluida. Evidências acumuladas sugerem que o BBB desempenha um papel na doença neurológica, gerando chips BBB personalizados derivados de iPSCs de indivíduos com uma doença neurológica genética.
Será possível estudar o papel do BBB na saúde e na doença. Este método também pode ser útil para empresas farmacêuticas, que podem usar esta plataforma BBB humana para testar a penetrabilidade de drogas neurológicas candidatas no cérebro humano. A aplicação de tecnologias organ-on-chip geralmente requer habilidades de engenharia especializadas.
O uso de plataformas disponíveis comercialmente permite a aplicação dessa tecnologia em qualquer laboratório biologicamente orientado. Para começar, leve o prato contendo os chips preparados para o armário de biossegurança. Usando uma pipeta P200, lave suavemente ambos os canais adicionando 200 microliters de meio de diferenciação neural na entrada e puxando o líquido da tomada.
Evitando o contato com as portas, aspire cuidadosamente gotículas de mídia em excesso da superfície do chip. Agitar suavemente a suspensão da célula para garantir uma suspensão celular homogênea. Para semear as células progenitoras neurais derivadas do iPSC no canal superior para gerar o lado cerebral, adicione uma ponta P200 contendo 30 a 100 microliters de suspensão celular na concentração de uma vez 10 às seis células por mililitro até a entrada do canal superior, e solte suavemente a ponta da pipeta.
Pegue uma pipeta P200 vazia, pressione o êmbolo, insira na saída superior do canal e puxe cuidadosamente a suspensão de uma célula pela ponta. Transfira o chip para o microscópio para verificar a densidade de semeadura e a distribuição homogênea das células dentro do canal superior. Depois de confirmar a densidade celular com 20%, coloque imediatamente os chips na incubadora por duas horas a 37 graus Celsius.
Depois disso, lave as células que não se prendem adicionando um meio de diferenciação neural fresco na entrada e puxando o líquido através da pipeta da tomada. Mantenha as células em condições estáticas a 37 graus Celsius com uma reposição média de diferenciação neural diária. Depois que os iNPCs tiverem anexado ou em um dia subsequente após a semeadura, leve o prato contendo os chips preparados para o armário de biossegurança.
Lave suavemente o canal inferior com 200 microliters de meio celular endotelial. Evitando o contato com as portas, aspira cuidadosamente gotículas de excesso de célula endotelial média da superfície do chip, certificando-se de deixar o meio em ambos os canais. Agitar suavemente a suspensão da célula para garantir uma suspensão celular homogênea.
Usando uma pipeta P200, elasve 30 a 100 microliters da suspensão celular microvascular microvascular derivada do iPSC na concentração de 14 a 20 vezes 10 às seis células por mililitro, e coloque a ponta na entrada do canal inferior. O passo mais crítico para alcançar propriedades de barreira funcional é a semeadura de células endoteliais microvasculares cerebrais. É crucial que as células de sementes em densidade adequada evitem a formação de bolhas para verificar a distribuição homogênea dentro do chip de órgão.
Pressione o êmbolo em uma pipeta P200 com uma ponta vazia, insira na saída inferior do canal e solte lentamente o êmbolo da pipeta para puxar cuidadosamente a suspensão de célula única através do canal inferior. Aspire a suspensão do excesso de células da superfície do chip. Evite contato direto com as portas de entrada e saída para garantir que nenhuma suspensão celular seja aspirada fora dos canais.
Transfira o chip para o microscópio para verificar a densidade de semeadura. O canal inferior está cheio de células sem lacunas observáveis no meio. Depois de confirmar a densidade celular correta, semeou as células nos chips restantes.
Para fixar as células na membrana porosa, que está localizada em cima do canal inferior, inverta cada chip e deixe descansar em um berço de chip. Coloque um pequeno reservatório contendo DPBS estéreis dentro da antena de 150 milímetros para fornecer umidade para as células. Incubar os chips a 37 graus Celsius por aproximadamente três horas ou até que as células do canal inferior tenham sido anexadas.
Uma vez que as células endoteliais microvasculares cerebrais derivadas do iPSC tenham sido anexadas, gire os chips de volta para uma posição vertical para permitir o apego celular à parte inferior do canal inferior. 48 horas após a semeadura das células microvasculares microvasculares cerebrais derivadas do iPSC, equilibram a temperatura do meio das células endoteliais aquecendo-se em um banho de água Celsius de 37 graus por uma hora. Em seguida, desgas o meio por incubação sob um sistema de filtragem movido a vácuo por 15 minutos.
Em seguida, higienize o exterior da embalagem do módulo portátil e bandejas com 70% de etanol, limpe e transfira para o armário de biossegurança. Abra a embalagem e coloque os módulos na bandeja Oriente-os com os reservatórios em direção à parte de trás da bandeja. Pipeta três mililitros da mídia pré-equilibrada e quente para cada reservatório de entrada.
Adicione o meio de cultura celular endotelial ao reservatório de entrada do canal inferior e meio de diferenciação neural ao reservatório de entrada do canal superior do canal superior. Em seguida, pipeta 300 microliters da mídia pré-equilibrada e quente para cada reservatório de tomada, diretamente sobre cada porta de tomada. Coloque até seis módulos portáteis em cada bandeja.
Leve as bandejas para a incubadora e deslize completamente para dentro do módulo de cultura com a alça da bandeja voltada para fora. Selecione e execute o ciclo primo no módulo de cultura. Feche a porta da incubadora e permita que o módulo de cultura forque os módulos portáteis por cerca de um minuto.
O ciclo de escoramento é concluído quando a barra de status estiver pronta. Remova a bandeja do módulo de cultura e leve-a para o armário de biossegurança. Inspecione a parte inferior de cada módulo portátil no gabinete de biossegurança para verificar se os módulos portáteis foram preparados com sucesso.
Procure a presença de pequenas gotículas em todas as quatro portas. Se algum módulo portátil não mostrar gotículas, reprise o ciclo primo nesses módulos. Se alguma mídia escorrer sobre a bandeja, que ocorre com mais frequência pelos portos de saída, limpe a bandeja com 70% de etanol.
Em seguida, lave suavemente ambos os canais de cada chip com meio de cultura quente e equilibrado específico para remover quaisquer possíveis bolhas no canal e coloque pequenas gotículas de mídia na parte superior de cada porta de entrada e saída. Insira os chips com as transportadoras nos módulos portáteis e coloque até seis em cada bandeja. Insira as bandejas no módulo de cultura.
Programe as condições adequadas de cultura do chip de órgão, como vazão e alongamento, no módulo de cultura. Assim que o ciclo de regulação estiver concluído, que leva aproximadamente duas horas, as condições programadas começam. Depois disso, o módulo de cultura começa a fluir nas condições de cultura de chip de órgão predefinido.
A imunocitoquímica no chip de barreira hematoencefálica baseado em iPSC sete dias após a semeadura mostra as esferas de EZ diferenciadas em uma população de células neurais mistas no canal superior do cérebro, incluindo astrócitos beta-positivos S100, células progenitoras neurais positivas nestin, bem como astrócitos positivos GFAP, e neurônios beta III tubulin-positivos. Células endoteliais microvasculares microvasculares derivadas do IPSC semeadas no canal do lado do sangue inferior expressaram GLUT-1 e PECAM-1. A avaliação da permeabilidade do chip de barreira hematoencefálica demonstra que o chip de órgão semeado com células microvasculares cerebrais derivadas do iPSC e esferas EZ tinha uma barreira apertada em comparação com chips de órgão semeados apenas com células microvasculares microvasculares cerebrais derivadas do iPSC.
Os chips de órgão semeados apenas com esferas EZ não apresentaram nenhuma propriedade de barreira. Desde o tratamento superficial inicial do canal até a troca média todos os dias, evite a formação de bolhas no canal. Ao longo da etapa do protocolo em que reagente de ativação de superfície, matriz extracelular ou meio contendo células precisam ser inseridos através dos canais, é extremamente importante verificar cuidadosamente se nenhuma bolha é encontrada.
O ensaio de permeabilidade pode ser realizado para avaliar a penetrabilidade cerebral humana das drogas candidatas. Essa abordagem pode servir para testar possíveis terapêuticas. A aplicação do chip BBB baseado em iPSC permite estudar o papel do BBB em diversas doenças neurológicas.
No futuro, essa plataforma pode ser útil para aplicações preditivas e personalizadas de medicamentos.
