Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a regulação genética da formação e manutenção da barreira hemencefálica durante múltiplos estágios de desenvolvimento de drosophila. Este método também pode ser adaptado para examinar a permeabilidade de outras barreiras, como o epitélio intestinal em uma variedade de organismos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a avaliação da função de barreira hemencefálica em tecidos vivos.
A demonstração visual deste método é fundamental, pois as manipulações da amostra podem ser difíceis e muitas etapas requerem muita atenção aos detalhes. Para a coleta de embriões coloque no mínimo 50 fêmeas virgens com 20 a 25 machos por garrafa com alimentos ágar de farinha de milho e incubar essas moscas por um a dois dias antes de iniciar as coletas. Um dia antes da coleta, aqueça pratos de ágar de suco de maçã a 25 graus Celsius durante a noite.
Na manhã seguinte, transfira as moscas anestesiadas com dióxido de carbono para uma gaiola de coleta e coloque um prato de ágar de suco de maçã pré-aquecido com uma pequena mancha de pasta de levedura na extremidade aberta da gaiola. Em seguida, fixar a placa na gaiola com a manga vermelha. Para limpar embriões mais velhos, permita que as moscas coloquem ovos em um prato de ágar de suco de maçã por uma hora a 25 graus Celsius.
No final da incubação, inverta o lado da malha da gaiola para baixo e bata as moscas até o fundo da gaiola. Substitua o ágar de suco de maçã por um novo prato de ágar de suco de maçã pré-aquecido por uma pequena mancha de pasta de levedura. Deixe as moscas colocarem ovos na nova placa por mais uma hora a 25 graus Celsius.
Para coletar embriões de estágio final 17 para injeção, substitua a placa de ágar de suco de maçã por uma nova placa pré-aquecida por uma medíola de pasta de levedura. E deixe as moscas colocarem ovos na placa a 25 graus Celsius. Após uma hora, substitua a placa e aduque a placa por embriões coletados por 19 horas a 25 graus Celsius para que os embriões sejam de 20 a 21 horas no momento da imagem.
Ao final da incubação de 19 horas, remova a placa de coleta de embriões da incubadora e cubra a superfície da placa com PbTx. Use um pincel para soltar os embriões da superfície da placa em um filtro de malha de nylon de 70 micrômetros. E coloque o coador com embriões em solução de alvejante de 50% em uma placa de Petri de 100 milímetros por cinco minutos com agitação ocasional à temperatura ambiente para descoriolá-los.
No final da incubação, enxágue os embriões três vezes girando o coador em PbTx fresco, usando uma nova placa de Petri para cada lavagem. Lave os embriões para um lado do coador com PbTx e use uma pipeta de vidro para transferir os embriões para uma laje de gel de 2%. Remova o excesso de líquido com papel filtro.
Alinhe de seis a oito embriões na laje com os posteriores à direita e os lados dorsais voltados para cima e pressione firmemente um pedaço de fita de dupla face afixada em um slide em cima dos embriões. Em seguida, desmufique os embriões à temperatura ambiente por cerca de 25 minutos antes de cobrir os espécimes com óleo halocarboneto. Para a coleta larval, configure uma cruz com 5 a 10 moscas fêmeas virgens do genótipo desejado e metade dos machos do genótipo desejado em um frasco com alimentos Cornmeal Agar.
Depois de cinco a sete dias a 25 graus Celsius, dependendo do genótipo, use fórceps para coletar suavemente terceiras larvas instar errantes do frasco e enxaguar as larvas com PBS para remover qualquer alimento preso. Transfira as larvas para um prato de ágar de suco de maçã para genotipagem conforme necessário antes de usar um pincel para secar as larvas em um tecido. Em seguida, use fórceps para transferir de seis a oito larvas para um slide preparado com fita dupla face.
Antes da injeção, use um puxador de micropipette para puxar tubos capilares em uma forma padrão de agulha para injeções de D.Melanogaster e ancorar as agulhas em argila em uma placa de Petri. Para injeção de embrião, use uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 20 microliteres para carregar uma agulha preparada com 5 microlitres de 10 kilodalton dextran conjugados ao sulforhodamine 101 cloreto de ácido e carregar a agulha em um suporte de agulha. Posicione a agulha em um micromanipulador preso a uma base de aço e ajuste o aparelho de injeção para 50 libras por polegada quadrada e de 5 a 10 milissegundos com uma faixa de 10.
Coloque o slide no estágio do micromanipulador e escove a borda da agulha contra a borda da fita de dupla face em um ângulo de 45 graus para criar uma ponta ligeiramente angular quebrada apenas o suficiente para permitir o fluxo do dextran de 10 kilodalton através da abertura. Bombeie o pedal do pé até que o corante esteja na ponta da agulha. Alinhe a agulha de modo que ela seja paralela ao embrião e puna a extremidade posterior da amostra.
Bombeie o pedal do pé para injetar dois nanoliters de corante no espécime. Observe o tempo de injeção para fins de incubação e continue descendo o slide para injetar amostras adicionais. Para injeção larval, faça uma abertura angular ligeiramente maior do que a que é usada para injetar embriões e inclinar a agulha ligeiramente para baixo em direção ao espécime antes de injetar as larvas com 220 nanolitros semelhantes aos demonstrados para espécimes embrionários.
No final da incubação de injeção de 10 minutos, use um aplicador de ponta de algodão para aplicar geleia de petróleo nos lados direito e esquerdo das amostras no slide como espaçador. Posicione o deslizamento da tampa em cima e coloque o slide no estágio do microscópio confocal. Selecione o objetivo de 20X e a imagem das amostras ao longo da profundidade de cada embrião.
Em seguida, calcule a porcentagem de amostras com uma barreira hemencefálica comprometida de acordo com a fórmula. Antes de iniciar o procedimento de dissecção, use esmalte para montar dois deslizamentos de tampa espaçados a aproximadamente 0,5 centímetros de distância em um slide e coloque uma larva injetada no PBS no slide no final da incubação de 30 minutos. Usando um par de fórceps, segure a larva no meio do corpo larval e use um segundo par de fórceps para separar as metades anterior e posterior da larva.
Em seguida, use um par de fórceps para segurar a região anterior nos ganchos da boca e use o segundo par de fórceps para inverter a parede do corpo sobre a ponta do primeiro par de fórceps. O cérebro e o fio do nervo ventral serão expostos. Separe o cérebro e o fio do nervo ventral da parede do corpo cortando nervos, se necessário, e remova a parede do corpo da lâmina.
Cubra a amostra com 10 microlitres de 80% glicerol. Em seguida, coloque um deslizamento de cobertura em cima da amostra para imagem e imagem das amostras para determinar a porcentagem de amostras com uma barreira hemoencefálica comprometida como demonstrado. Quando os embriões do tipo selvagem 17 são injetados com 10 kilodalton dextran conjugados à sulforhodamina 101 corante fluorescente de cloreto ácido, a grande molécula de dextran é excluída do fio nervoso ventral, como esperado.
Embriões mutantes heterozigos crus 1 exibem uma barreira hematoencefálica intacta, semelhante à observada em embriões de controle do tipo selvagem. Em contraste, embriões mutantes crus homozigos apresentam defeitos na integridade da barreira hematoencefálica, com o dextran de 10 kilodalton inundando o cordão nervoso ventral, indicando uma falha da barreira hematoencefálica para formar. Em amostras larvais de controle do tipo selvagem, 10 kilodalton dextran não consegue penetrar na barreira hemencefálica e é excluído do cérebro e do fio nervoso ventral.
Ao tentar este procedimento, o envelhecimento adequado dos embriões é fundamental para garantir que as amostras sejam examinadas em uma idade em que se espera que a formação de barreiras hefencefálicas esteja completa. Após este procedimento, mutantes que exibem uma barreira hemencefálica comprometida podem ser estudados usando genética, imunohistoquímica e microscopia para entender melhor a função genética no nível celular. Essa técnica permitirá aos pesquisadores identificar genes adicionais que são críticos para o estabelecimento e manutenção da barreira hemencefálica.
