Este trabalho é financiado pelo projeto DA UE PATROLS (Physiologicamente Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) e pelo Ministério da Saúde, Bem-Estar e Esporte holandês (projeto V/050012). Gostaríamos de agradecer à Dra.

1. Preparar o meio de cultura celular (CCM)
<ol><li>Prepare uma garrafa de 500 mL de meio essencial mínimo (MEM) complementada com glutamina.</li>
	<li>Adicione 5 mL de penicilina-estreptomicina (ou seja, penicilina U/mL e 100 μg/mL streptomicina).</li>
	<li>Adicione 5 mL de solução de aminoácidos não essenciais (NEAA).</li>
	<li>Adicione 10 mL de anfotericina B (opcional).</li>
	<li>Adicione 50 mL de FBS (calor inativado, siga o protocolo ATCC para inativação de calor; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guidas/AnimCellCulture_Guide.ashx, página 19)).</li>
</ol>2. Subcultura de células Calu-3
NOTA: As células Calu-3 são cultivadas em frascos de cultura celular T75 ou T175 a 37 °C e 5% de CO2. As células são passagemdas a 60-80% de confluência a cada 7 dias com renovação do CCM a cada 2-3 dias. CCM é derramado e CCM fresco (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL, e T175 = 25 mL) é pipetado no frasco e o frasco é colocado de volta na incubadora. As células devem ser passagemdas pelo menos 2x após o descongelamento, antes de serem utilização em experimentos, ou antes de congelar, e devem ser passagemdas não mais do que 25x no total.
<ol><li>Confirme se o frasco é 60-80% confluente verificando sob um microscópio leve.</li>
	<li>Despeje o CCM do frasco.</li>
	<li>Lave as células 2x com 5 mL de Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks sem cálcio e sem magnésio. Descarte o HBSS após cada lavagem. O HBSS remove o soro, que inibe a trippsina.</li>
	<li>Adicione 3 mL de trypsin-EDTA para um T75 (4 mL para um T175) e coloque o frasco de volta na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 10-15 min. Verifique após 10 minutos, garantindo que as células se desvincularam da superfície do frasco. Caso as células sejam cultivadas para >80% de confluência, elas não se desprenderão usando trippsina 0,05% e trypsin 0,25% poderia ser usada.</li>
	<li>Adicione 6 mL (ou seja, dobre o volume trypsin-EDTA originalmente adicionado) de CCM ao frasco e balance suavemente os frascos para garantir a mistura adequada. Isto é para garantir que a trippsina tenha sido neutralizada pelo FBS no CCM e sua atividade nas células paradas. Se a trippsina puder manter contato com as células por muito tempo, elas não se recolocarão quando colocadas em um novo frasco de cultura celular.</li>
	<li>Despeje o conteúdo completo do frasco em um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar as células por 5 min a 130 x g,garantindo que a centrífuga esteja corretamente equilibrada.</li>
	<li>Devolva o frasco contendo as células de volta às condições assépticas e remova o supernatante suavemente, sem perturbar a pelota. O supernasce pode ser derramado e o restante esbofinha, garantindo que a pelota não seja perturbada.</li>
	<li>Resuspenda a pelota celular em 1 mL de CCM por pipetar para cima e para baixo até que todas as células sejam suspensas (ou seja, não são observadas pelotas ou agglomerados celulares). CcM adicional pode ser adicionado para diluir a suspensão da célula.</li>
	<li>Conte as células, mortas e vivas, em 1 mL de CCM usando um hemócito. Se necessário para uma contagem adequada, dilui as células em 3 ou 4 mL.</li>
	<li>Suspenda as células no volume CCM necessário e adicione a suspensão da célula em cada frasco. Para alcançar cerca de 80% de confluência em uma semana, sementes 2 x 106 células em um T75 ou 6 x 106 células em um T175.</li>
	<li>Balance suavemente o frasco e coloque-o de volta na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua por CCM fresco a cada 2-3 dias e subcultura quando as células atingirem 60-80% de confluência.</li>
</ol>3. Semeando células Calu-3 em pastilhas culturais
NOTA: As pastilhas estão disponíveis com diferentes tamanhos de poros. Pequenos tamanhos de poros (por exemplo, 0,4 μm) têm a vantagem de que as células crescem mais facilmente e podem alcançar uma boa barreira já após 5 dias de cultivo em condições submersas, medida pela Resistência Elétrica Epitelial Trans (TEER). No entanto, quando interessados na translocação de partículas, esses poros são muito pequenos e vão prender as partículas. Portanto, tamanhos maiores de poros (por exemplo, 3 μm) são geralmente escolhidos para testar partículas. Ao usar um tamanho maior dos poros, as células precisam de períodos de tempo mais longos (por exemplo, 7 a 10 dias de cultivo em condições submersas) para obter um bom TEER.
<ol><li>Prepare a suspensão celular com concentração conhecida seguindo as etapas 2.1-2.10.</li>
	<li>Células diluídas a uma concentração de 5 x 105 células/mL em CCM pré-caçada para 6 inserções de poço ou 2,5 x 105 células/mL para 12 inserções de poço.</li>
	<li>Pegue uma placa de cultura celular com pastilhas e coloque em condições assépticas.</li>
	<li>Encha o lado basolateral com 2 mL de CCM pré-armado para 6 inserções de poço, ou 1 mL para 12 inserções de poços. Ao adicionar o meio de cultura, tire a inserção usando pinças.</li>
	<li>Misture cuidadosamente a suspensão da célula por tubulação para cima e para baixo. Pipeta 1,0 mL para 6 inserções de poços e 500 μL para 12 inserções de poços (equivalente a 100.000 células/cm2) na parte superior da membrana na inserção de cultura celular com poros de 0,4 μm. Para 3,0 μm de poros, aumente a densidade celular para 128.000 células/cm2.</li>
	<li>Cubra a placa de cultura celular e incubar a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Mude o CCM a cada 2 a 3 dias.</li>
	<li>Que as células se tornem confluentes por 7 dias sob condições submersas antes de continuar a cultura no ALI.</li>
	<li>Meça teer.<ol>
<li>Tome um Voltohmmeter Epitelial complementado com chopstick electrode set e carregue o sistema de bateria durante a noite.</li>
		<li>Desconecte o Voltohmômetro do carregador e conecte o eletrodo de pauzinho.</li>
		<li>Limpe o eletrodo com 70% de etanol.</li>
		<li>Coloque o eletrodo no CCM colocando o eletrodo mais longo na mídia de cultura externa até que ele toque a parte inferior do prato e coloque o eletrodo mais curto na mídia sem tocar na membrana.</li>
		<li>Comece com uma pastilha vazia sem células. Aguarde até que a medição estabilize e anote a resistência em Ohms. Esta medida é a resistência da membrana de inserção sem qualquer célula (ou seja, resistência em branco).</li>
		<li>Repita a medição para cada inserção e subtraia a resistência em branco para obter a verdadeira resistência.</li>
		<li>Para análise de dados, multiplique os valores de resistência pela área de superfície da inserção em Ω x cm2. Para uma inserção de 6 poços, a área de superfície é de 4,67 cm2. Assim, se uma resistência de 600 Ohm for medida e o fundo for de 120 Ohm, a resistência é de 480 Ohm, que é então multiplicada pela área de superfície de 4,67 cm2 para um total de 2.241,6 Ohm x cm2. O TEER deve ser >1.000 Ω x cm2 para continuar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova o CCM do lado apical das pastilhas.</li>
	<li>Adicione 2 mL de CCM pré-armado para 6 bem e 1 mL para 12 inserções bem ao lado basolateral do poço (ou seja, sob a inserção de cultura celular). O CCM deve tocar a membrana a partir da parte inferior, mas não vazar na parte superior da inserção.</li>
	<li>Neste ponto as células são apicamente expostas ao ar, que é referido como cultivo no ALI.</li>
	<li>Células de cultura no ALI na incubadora a 37 °C e 5% DE CO2 por 7 dias antes da exposição.</li>
	<li>Mude o CCM basolateral a cada 2-3 dias. As células podem ser usadas no ALI por 6 semanas.</li>
</ol>4. Preparando a configuração de exposição
NOTA: As seções 5-7 descrevem os preparativos para exposição de partículas usando uma estação de exposição automatizada (AES, ver Tabela de Materiais). A configuração para nebulização e caracterização de partículas também é compatível com outros sistemas de exposição ali de outros fabricantes. Como exemplo, a exposição a partículas é descrita abaixo. Esses sistemas também podem ser usados para outras exposições, como sensibilizadores, fumaça de cigarro e escapamento diesel. A Figura 1 mostra o AES e um módulo de exposição. A Figura 2 mostra uma representação esquemática da configuração de exposição, incluindo todos os outros instrumentos.
<ol><li>Antes de iniciar uma exposição utilizando o AES, conecte o sistema a vários instrumentos para medir características do aerossol; estes são medidos em um fluxo lateral pouco antes dos aerossóis entrarem no gabinete. NOTA: Um divisor de fluxo é usado para conectar o fluxo lateral ao equipamento de caracterização de exposição. Geralmente, são utilizados os seguintes equipamentos: dimensionador de partículas de mobilidade de digitalização (SMPS), dimensionador óptico de partículas (OPS), contador de partículas de condensação (CPC), elemento afilado oscilando microequilípmo (TEOM). As medidas SMPS e OPS são realizadas 1x por hora e utilizam o mesmo tubo do divisor de fluxo. O CPC e o TEOM realizam medição contínua e os dados de ambos estão conectados a um data logger modelo Squirrel 2020. Além disso, a concentração de massa gravimétrica é determinada por meio de um microequilípmo na umidade relativa controlada (40-70%) e condições de temperatura (21-23 °C). Os filtros de teflon são pesados antes e depois de cada exposição para confirmar a concentração de exposição. Para capturar o escapamento, é utilizado um filtro HEPA. A configuração, incluindo suspensões de nanomateriais (ENM) projetadas e nebulizadores são todos colocados em um armário de fluxo para evitar qualquer exposição às pessoas. O AES pode ser usado para testar muitos tipos diferentes de ENMs, incluindo metais e óxidos metálicos.</li>
	<li>Prepare uma suspensão de nanomateriais pouco antes da exposição. Normalmente, uma suspensão de 1% é preparada como uma solução de estoque. Por exemplo, suspenda 100 mg de nanomaterial por 10 mL de água pura. NOTA: Para exposição ao DQ12, 300 mgs são usados para atingir cerca de 2 μg/cm2. Esse montante pode ser usado em uma única exposição ou dividido em exposições repetidas (por exemplo, 300 mgs é suspenso em 30 mL para uma única exposição ou 21,5 mgs é suspenso em 2,15 mL fresco todos os dias durante 3 semanas de exposição repetida). A suspensão é preparada recentemente em cada dia de exposição. A suspensão de partículas é sônica por 16 min usando sônica de sonda. O volume da solução de estoque de 1% é ajustado para um volume total de 100 mL adicionando água pura.</li>
	<li>Coloque a suspensão ENM em uma pequena garrafa com uma tampa e um agitador magnético para evitar a fixação das partículas. Conecte a garrafa a uma bomba peristáltica através de um tubo pequeno e ajuste o fluxo para 25 mL/h.</li>
	<li>Conecte a bomba peristáltica a um bocal de pulverização e ajuste as configurações para permitir a aerossolização contínua.</li>
	<li>O bocal de pulverização é montado em um tubo de alumínio de 60 cm de comprimento (câmara de mistura, diâmetro de 15 cm, aquecido a 60 °C). A configuração é conectada ao AES através de um tubo de cobre de 1,5 metros de comprimento (diâmetro de 15 cm). Em cima do AES, um impactor remove todos os aerossóis maiores que 2,5 μm.</li>
	<li>Conecte o bocal de pulverização a 3 barras de ar comprimido através de dois controladores de fluxo de massa (MFC) para permitir a nebulização das suspensões. Um fluxo de 14 L/min é usado para o bocal de pulverização, o outro MFC para mistura do ar no tubo.</li>
	<li>Um dia antes do início da exposição, ligue o AES para permitir que o gabinete atinja uma temperatura de 37 °C.</li>
	<li>Ligue o fluxo de ar e a umidade no gabinete 2h antes do início da exposição, para atingir 85% de umidade. Ligue o aquecimento das câmaras de exposição nas quais as pastilhas com as células serão colocadas.</li>
	<li>Ligue o microequilípmo de quartzo (QCM) e defina o valor inicial em 0 usando o software. Comece a registrar. A cada 10 s a massa é medida e expressa como ng/cm2.</li>
	<li>Aqueça a mídia da cultura celular a 37 °C em um banho de água (~20-30 min).</li>
</ol>5. Preparando células Calu-3 para exposição
NOTA: Para uma exposição típica de ALI usando o AES, são necessárias 15-20 inserções com uma camada celular confluente. Estes consistem em 3 controles de ar limpo, 3 controles de incubadora que serão manuseados de forma semelhante às outras pastilhas sem exposição no AES, 6-8 inserções para exposição aerossol (dependendo do uso de 0, 1 ou 2 microbalancens), 1-3 inserções para medições de controle (como liberação máxima de LDH) e 3 inserções sobresssalentes no caso de o TEER de algumas das pastilhas não for suficiente. As células devem ter um TEER de >1.000 Ω x cm2 para continuar.
<ol><li>No primeiro dia de exposição, lave as células 1x com CCM, verifique a morfologia celular e meça o TEER do modelo celular usando um Voltohmmeter. As células devem formar uma monocamada apertada sem lacunas.</li>
	<li>Coloque 2 mL/1 mL de CCM tamponado HEPES sem FCS para o lado basolateral de 6 placas de poço/12 e transfira as pastilhas de cultura com células para as novas placas. NOTA: Durante a exposição, nenhum CO2 está presente no AES. Portanto, o meio de cultura tamponada HEPES (25 mM HEPES) é utilizado durante o transporte e exposição. Este meio é usado tanto para as células expostas no AES como para as células de controle da incubadora.</li>
	<li>Caso o tempo de transporte das culturas celulares para o AES seja superior a 5 minutos, coloque as células em uma incubadora portátil de 37 °C durante o transporte.</li>
</ol>6. Manusear o AES durante uma exposição
<ol><li>No AES, preencha os módulos de exposição com CCM tamponado com HEPES sem soro de panturrilha fetal (FCS). A quantidade de CCM depende da unidade utilizada e do tipo de inserção de cultura celular. Tenha em mente que para manter as células no ALI, o meio deve atingir a parte inferior da membrana, mas não deve vazar em cima da membrana. Ao usar 6 inserções de poço, adicione 6 mL de CCM tamponado hepes aos módulos de exposição.</li>
	<li>Transfira as pastilhas com células das placas para os módulos de exposição usando pinças estéreis. Verifique se não há bolhas de ar no lado basolateral das células e remova qualquer CCM no lado apical das pastilhas. Caso haja algumas bolhas de ar no lado basolateral, gire suavemente as pastilhas usando as pinças estéreis até que sejam removidas. Mantenha as placas contendo CCM em uma incubadora para transferência após uma exposição.</li>
	<li>Use o visor touchscreen para escolher a duração da exposição, a taxa de fluxo de ar e o aprimoramento da deposição eletrostática. O display também pode ser usado para verificar a umidade e a temperatura. Normalmente, é escolhida uma duração de exposição de 4h, com uma vazão de 50 mL/min nas pastilhas a 37 °C e 85% de umidade. NOTA: Os módulos do primeiro nível(Figura 1)são utilizados para exposição limpa do ar; as inserções neste nível são usadas como controles de exposição ao ar limpo. Os outros módulos do segundo e terceiro nível podem ser usados para exposição aerossol, incluindo dois módulos para microequilípeos de cristal de quartzo (QCM) para medir a deposição on-line.</li>
	<li>O teste de vazamento deve ser realizado antes de iniciar a exposição. O vazamento precisa ser inferior a 5 mL/min. Siga as instruções no visor AES. Quando o teste de vazamento terminar, a exposição pode ser iniciada. Em caso de vazamento, a tubulação deve ser verificada.</li>
	<li>Ao final da exposição, abra a porta de um módulo AES, abra os módulos de exposição, coloque a cultura celular de volta às placas de cultura celular e transfira as placas para a incubadora portátil.</li>
	<li>Colete a mídia dos módulos (ou seja, amostras expostas) e das placas (ou seja, controles de incubadora) para análise posterior, como a medição de lactato desidrogenase (LDH).</li>
	<li>De volta ao laboratório de cultura celular, transfira as pastilhas de cultura celular para placas cheias de CCM padrão fresco. Coloque as placas de cultura celular na incubadora até a próxima exposição ou até a análise.</li>
	<li>Após o dia final de exposição, coloque as pastilhas na incubadora até o dia seguinte.</li>
	<li>No dia seguinte à exposição final, adicione CCM ao lado apical para medir o TEER usando um Voltohmmeter. Colete o APICAL e o CCM basolateral separadamente para análise de citocinas.</li>
	<li>Remova todos os CCM e realize um ensaio de viabilidade celular adicionando, por exemplo, um reagente de proliferação ao lado apical.</li>
</ol>7. Limpeza do AES
<ol><li>Encha os módulos de exposição com água, espere 1 min e retire a água. Em seguida, encha os módulos com 70% de etanol, deixe por 10 minutos e retire o etanol. Limpe as trombetas de exposição também com 70% de etanol.</li>
	<li>Pare o controle de umidade de 85%, mas deixe a temperatura do gabinete a 37 °C para o próximo experimento.</li>
</ol>

<ol>
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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-day+inhalation+toxicity+study+of+three+types+of+synthetic+amorphous+silicas+in+Wistar+rats+and+post-exposure+evaluations+for+up+to+3+months.">Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months.</a> Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).</li><li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+induced+by+intratracheal+instillation+of+ultrafine+amorphous+silica+particles.">Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles.</a> Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+silver-nanoparticles+and+silver-ions+to+lung+cells+in+vitro+at+the+air-liquid+interface.">Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface.</a> Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).</li><li>M&#252;lhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+toxicity+determination+by+in+vitro+exposure+at+the+air+liquid+interface+with+an+integrated+online+dose+measurement.">Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement.</a> Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).</li><li>van Ravenzwaay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+fate+and+effects+of+three+particles+of+different+surface+properties:+nano-TiO(2),+pigmentary+TiO(2)+and+quartz.">Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz.</a> Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).</li><li>Henderson, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+inflammatory+response+of+the+lung+to+inhaled+versus+instilled+particles+in+F344+rats.">A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats.</a> Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um método para a cultura de células epiteliais brônquias humanas sob ALI e expor este modelo brônquico a aerossóis ou gases. A vantagem de usar células Calu-3 é que elas formam junções apertadas, permanecem uma monocamada, são capazes de suportar o fluxo de ar, e podem ser cultivadas por semanas no ALI, ao contrário de muitos outros tipos de células (por exemplo, 16HBE, H292 e BEAS-2B). O uso da estaçãode exposição automatizada ® VITROCELL (AES) tem a vantagem de que as células podem ser expostas em condições realistas e relevantes, pois baixas concentrações podem ser aplicadas usando um fluxo de ar contínuo.
Sistemas de fluxo contínuo, como o AES, têm vantagens em relação ao uso de sistemas de nuvem3,32, que utilizam uma única nebulização de uma suspensão. O fluxo contínuo é mais realista e muitas variáveis como vazão, umidade e temperatura são controladas. Além disso, a deposição pode ser aprimorada usando um campo elétrico. Finalmente, características do aerossol como tamanho, concentração de números e massa são monitoradas on-line. Uma desvantagem é que os sistemas de fluxo contínuo são mais complexos em comparação com os sistemas de nuvem. Por isso, é importante realizar experimentos preparatórios que se concentrem nas características de partículas do aerossol e na dose entregue na inserção. A concentração inicial das partículas e das configurações do AES pode então ser ajustada para alcançar a dose desejada nas células33. Dependendo do tipo de partículas que estão sendo testadas, o método de geração de aerossol pode diferir. O uso de deposição eletrostática depende do tipo de partícula e funciona melhor para partículas metálicas. Para partículas com uma superfície positiva carga um campo eletrostático negativo deve ser aplicado e vice-versa.
A seleção de concentrações de exposição pode ser difícil para qualquer experimento de exposição ar-líquido. Para as exposições do DQ12, o objetivo foi alcançar uma dose acumulada total de 1 μg/cm2 após 3 semanas de exposição, 5 dias por semana, 4h por dia. Esta dose é semelhante às doses que induziram um efeito in vivo21,25,27,32,33. Ao realizar as exposições, houve alguma variação entre diferentes dias de exposição. Embora a dose real depositada de 1,6 μg/cm2 seja maior do que a 1 μg/cm2 que foi destinada, a dose pode ter sido muito baixa para observar efeitos no modelo Calu-3. Apenas pequenas diferenças no TEER, viabilidade e resposta à citocina foram observadas entre a exposição ao ar limpo e a exposição ao DQ12, e essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Uma explicação para a observação de que a exposição ao DQ12 durante 3 semanas não induziu efeitos significativos nas células calu-3 é que os macrófagos estavam faltando do modelo Calu-3. Possivelmente, após a absorção do DQ12, macrófagos produzem citocinas proinflamatórias que podem afetar as células de Calu-3. Outra explicação é que o lote DQ12 que foi utilizado para os experimentos não foi tão reativo quanto o esperado. Ao usar o LPS como uma substância de controle positiva, o Calu-3 mostra uma resposta, medida por um aumento na liberação de LDH e um aumento na liberação de α TNF. Isso indica que o modelo pode detectar toxicidade.
O modelo de células Calu-3 tem muitas vantagens, como discutido na seção de resultados. Além disso, quando cultivadas por mais tempo no ALI, as células Calu-3 podem cultivar estruturas semelhantes a cílios13 e produzir muco11,12,13. Apesar dessas vantagens, o modelo tem limitações em relação à sua relevância fisiológica. As linhas celulares Calu-3 são originárias de um adenocarcinoma, enquanto 16HBE e BEAS-2B são originárias de tecido saudável. Infelizmente, os dois últimos não são adequados para a exposição repetida da ALI, pois não permanecem uma monoposta estável ao longo do tempo. Outra limitação do modelo Calu-3 é que ele representa apenas um único tipo de célula. No pulmão humano, vários tipos de células que interagem e respondem de forma diferente à exposição estão presentes. Partículas inaladas serão depositadas em diferentes regiões dos pulmões, dependendo do tamanho aerodinâmico. É aqui que as partículas entram em contato com a barreira celular epitelial, como imitado pelo modelo Calu-3. No pulmão humano, macrófagos alveolares são atraídos pelas partículas, engolfam-nas e as limpam dos pulmões. Os macrófagos também desempenham um papel essencial na resposta à inflamação à exposição de partículas. Portanto, esforços estão sendo feitos para estender o modelo Calu-3 adicionando macrófagos primários para imitar a barreira pulmonar mais de perto. A desvantagem dos macrófagos é que eles permanecem viáveis apenas por cerca de 7 dias quando cultivados em cima de células Calu-3 no ALI. Portanto, os macrófagos devem ser reassumatados semanalmente para transformar o modelo Calu-3 atual em um modelo de cocultura. A otimização do protocolo de cocultura está em andamento.
Dado o exposto acima, o modelo brônquico Calu-3 é um modelo adequado para exposição repetida a aerossóis de substâncias parcialmente solúveis, como produtos químicos provenientes de fumaça de cigarro e LPS. Estas substâncias solúveis induzem aumentos significativos nas respostas de citocinas nas células de Calu-3. Para testar partículas insolúveis, como o escapamento diesel e o DQ12, é necessário um modelo de cocultura, pois os macrófagos desempenham um papel crucial na indução de efeitos por exposição a partículas.
Para as exposições descritas, foram utilizadas membranas de inserção com poros de 3,0 μm. A principal razão para escolher esse tipo de inserção é que é possível testar a translocação de nanomateriais. Ao usar tamanho de poros menor de 0,4 μm, os aglomerados de partículas não serão capazes de atravessar a membrana de inserção. A desvantagem de usar um grande tamanho de poros é que as células precisam de um tempo maior para crescer confluentes e que é mais difícil visualizar a morfologia das células usando microscopia leve. Para verificar se as células formam uma monocamada confluente, o TEER deve ser >1.000 Ω x cm2 antes de iniciar uma exposição.
Em conjunto, o modelo brônquico Calu-3 apresentado aqui é adequado para uso para exposição repetida a aerossóis, pelo menos até 3 semanas. O modelo pode suportar ser cultivado e exposto através de um fluxo de ar contínuo e é capaz de detectar toxicidade ao epitélio brônquico.

Os pulmões são vulneráveis à exposição à inalação de partículas transmitidas pelo ar. Para avaliar a toxicidade potencial das partículas transportadas pelo ar, foram feitos progressos no desenvolvimento de sistemas de exposição de interface ar-líquido (ALI)1,2,3,4,5. Os sistemas de exposição ALI permitem modelos de exposição mais relevantes e realistas em comparação com a exposição submersa tradicional via meio cultural que altera as características e cinéticas das partículas6. Os sistemas de exposição ali colocam demandas específicas sobre os modelos de cultura celular, pois os modelos carecem de meio de cultura e, portanto, nutrientes no lado apical. Muitos modelos celulares são afetados negativamente por serem cultivados e expostos ao ar (por exemplo, secando) e só permanecem viáveis por alguns dias. Isso limita as condições de exposição que podem ser usadas nesses modelos: geralmente concentrações relativamente altas são aplicadas em um curto período de tempo como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas, que se estabelecem rapidamente). Tais condições experimentais não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas; assim, a relevância dos resultados pode ser questionada. Para superar essas limitações, o protocolo de cultura e exposição para um modelo brônquico composto pela linha de células epiteliais brônquicais humanas Calu-37 foi otimizado.
A maioria dos modelos pulmonares in vitro usados para exposição ali contêm outras linhas celulares como A549, BEAS-2B e 16HBE14o- (16HBE) ou células primárias como base8. Essas linhas celulares têm a desvantagem de que permanecem viáveis por apenas alguns dias quando cultivadas no ALI. Além disso, algumas dessas linhas de celular superessuem quando cultivadas por um período superior a 5 dias. Finalmente, as células A549 perdem junções funcionais e, portanto, não podem formar uma barreira apertada que é necessária para imitar os pulmões9,10. Células epiteliais primárias podem ser uma boa opção para a exposição ali, pois podem ser cultivadas no ALI por semanas. No entanto, as células primárias diferem de lote para lote, são mais difíceis de manter, e são mais caras em comparação com linhas celulares, o que as torna menos adequadas para testes de toxicidade e triagem. Ao comparar diferentes linhas de células epiteliais brônquias humanas (16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B), apenas as células Calu-3 cumprem todos os critérios necessários para exposição realista e repetida da ALI: permanecem viáveis por semanas enquanto cultivadas no ALI, fornecem uma alta barreira de integridade, não superarem demais e são fáceis de cultivar e manter. As células calu-3 são originárias de um adenocarcinoma e são capazes de produzir muco11,12. Há inconsistências quanto à possibilidade de as células desenvolverem cilia11,13. As células calu-3 também são um modelo adequado para estudar infecções pelo vírus sincicial respiratório (RSV) que infectam células epiteliais das vias aéreas ciliadas14.
Além do modelo celular, um sistema de exposição automatizado (AES) é usado para a exposição ar-líquido a aerossóis15,16. O AES tem a vantagem de usar um fluxo de ar contínuo para expor o modelo celular a aerossóis. Isso contrasta com outros sistemas de exposição ar-líquido que geralmente usam concentrações relativamente altas em um curto período de tempo como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas que se instalam rapidamente)17,18,19. Esses sistemas de nuvem não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas. Aplicando um fluxo de ar contínuo usando o AES, o modelo celular pode ser exposto a uma baixa concentração de partículas durante um período de tempo mais longo, refletindo condições realistas de exposição. Outra vantagem sobre os sistemas de nuvem é que o AES tem a opção de conectar instrumentos de caracterização de partículas, permitindo a medição do tamanho das partículas, concentração de números e massa ao longo do tempo. Uma limitação do AES é que ele usa fluxos de ar relativamente altos entre 10 mL/min e 100 mL/min.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01 M NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M (x10) PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;,7&#8217;-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab141525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated exposure station</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell proliferation reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit LDH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ12</td>
			<td>IOM</td>
			<td></td>
			<td>nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Ready-SET-Go</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>88-8086-86, 88-7399-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td>
			<td>EVOM2-STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow splitter</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>model 3708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate (F-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>MFC, Bronkhorst, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Sartorius, Goettingen, Germany</td>
			<td>ME-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>41090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray nozzle</td>
			<td>Schlick, Coburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon filters</td>
			<td>Pall</td>
			<td>R2PJ46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEOM</td>
			<td>Rupprecht &#38; Patashnick NY, USA</td>
			<td>series 1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>690175, 658175, 660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460, 3462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an air-liquid interface bronchial epithelial model for realistic, repeated inhalation exposure to airborne particles for toxicity testing

Para testes de toxicidade de partículas transmitidas pelo ar, sistemas de exposição de interface ar-líquido (ALI) foram desenvolvidos para testes in vitro, a fim de imitar condições de exposição realistas. Isso coloca demandas específicas nos modelos de cultura celular. Muitos tipos de células são afetados negativamente pela exposição ao ar (por exemplo, secando) e só permanecem viáveis por alguns dias. Isso limita as condições de exposição que podem ser usadas nesses modelos: geralmente concentrações relativamente altas são aplicadas como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas, que se instalam rapidamente) dentro de um curto período de tempo. Tais condições experimentais não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas. Para superar essas limitações o uso de uma linha celular epitelial brônquica humana, calu-3 foi investigado. Essas células podem ser cultivadas em condições de ALI por várias semanas, mantendo uma morfologia saudável e uma monocamada estável com junções apertadas. Além disso, este modelo brônquico é adequado para testar os efeitos de exposições repetidas a baixas concentrações realistas de partículas transmitidas pelo ar usando um sistema de exposição ALI. Este sistema usa um fluxo de ar contínuo em contraste com outros sistemas de exposição ali que usam uma única nebulização produzindo uma nuvem. Portanto, o sistema de fluxo contínuo é adequado para exposição repetida e prolongada a partículas transmitidas pelo ar, monitorando continuamente as características das partículas, concentração de exposição e dose fornecida. Em conjunto, este modelo brônquico, em combinação com o sistema de exposição contínua de fluxo, é capaz de imitar condições realistas e repetidas de exposição à inalação que podem ser usadas para testes de toxicidade.

Este artigo fornece um método para culminar e expor células epiteliais brônquicais humanas no ALI que imita condições realistas e repetidas de exposição à inalação que podem ser usadas para testes de toxicidade. Características do modelo celular e do sistema de exposição são essenciais para alcançar um modelo realista de exposição à inalação que pode ser usado para exposições repetidas. Os resultados dessas características são mostrados abaixo.
Requisitos e seleção do modelo celular
Ao selecionar um modelo celular adequado, devem ser levadas em conta as seguintes características:
<ol><li>O modelo celular deve ser capaz de formar uma monocamada confluente com junções apertadas em funcionamento para imitar a barreira pulmonar.</li>
<li>O modelo celular deve apresentar um desempenho ótimo quando exposto repetidamente ao ar condicionado (temperatura e umidade).</li>
<li>O modelo celular deve responder a uma exposição.</li>
</ol>Este estudo começou com quatro diferentes linhas de células epiteliais brônquias humanas: 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B. Estes são todos amplamente utilizados para testes de toxicidade de nanomateriais e produtos químicos. Das quatro linhas celulares, apenas as células Calu-3 cumpriram todos os requisitos acima. As células formaram uma monocamada com junções apertadas(Figura 3)que permaneceu uma barreira estável ao longo do tempo medida pelo TEER, enquanto as outras linhas celulares não formaram uma barreira ou apresentaram uma queda na função de barreira quando cultivadas no ALI(Figura 4). Além disso, H292 e BEAS-2B tendem a crescer demais em múltiplas camadas celulares quando cultivados por um período de tempo mais longo. A cultura tradicional de células submersas e a cultura ALI diferem muito, pois no lado basolateral os nutrientes apenas estavam disponíveis do lado basolateral e as células eram expostas a condições secas no lado apical. Essas condições podem causar estresse aos modelos celulares, o que pode ser observado medindo a viabilidade celular ao longo do tempo. As linhas celulares 16HBE, H292 e BEAS-2B apresentaram um aumento na liberação de LDH quando cultivadas no ALI, enquanto as células Calu-3 apresentaram apenas uma leve liberação de LDH(Figura 5).
Em seguida, foi testada a resposta do modelo Calu-3 às substâncias. Como substância de controle positivo, o LPS foi administrado via nebulização para o lado apical do modelo. A dose depositada foi de 0,25 μg/cm2. As células de Calu-3 apresentaram reação à lipopolíase (LPS) por um aumento na liberação de LDH e na liberação do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)(Figura 6).
Finalmente, a monocamada Calu-3 foi exposta a nanomateriais de sílica de quartzo (DQ12) (IOM, Edimburgo). A sílica cristalina pode induzir a silicose e também pode causar tumores pulmonares. Por isso, a Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC) classificou a sílica cristalina como um carcinógeno humano do Grupo I20. Acredita-se que o mecanismo de ação da sílica cristalina seja através da indução de inflamação persistente causada por sua superfície reativa21,22,23. Vários estudos in vivo em ratos e camundongos relatam a indução de inflamações e alterações histopatológicas, incluindo tumores e fibrose, após exposição de inalação à sílica cristalina24,25,26,27,28,29. Esses efeitos são todos observados após exposição repetida e/ou acompanhamento a longo prazo. O modelo Calu-3 foi usado para investigar se as observações dos estudos in vivo poderiam ser imitadas usando um modelo in vitro que poderia ser exposto repetidamente no ALI.
As células Calu-3 foram expostas por 3 semanas consecutivas, 5 dias por semana, 4h por dia ao DQ12. A dose depositada foi medida por meio de um QCM. A dose média depositada foi de 120 ng/cm2 por dia, com uma dose cumulativa de 1,6 μg/cm2,semelhante às doses induzindo um efeito in vivo. Outras características de partículas são mostradas na Tabela 1. Após 3 semanas de exposição, o DQ12 não induziu efeitos significativos na liberação de TEER, viabilidade celular e quimioattractant monocito 1 (MCP-1), em comparação com os controles de ar limpo(Figura 7). Como mais toxicidade do DQ12 era esperada com base nos dados in vivo, a reatividade das partículas foi verificada usando um ensaio acelular de acordo com o protocolo otimizado dentro do projeto DA UE GRACIOUS (entregue 5.3). A reatividade do lote DQ12 foi menor do que o esperado(Figura 8),ordens de magnitudes inferiores em relação às partículas de controle positivos preto carbono (CB). Essa falta de reatividade pode explicar a ausência de uma resposta de toxicidade no modelo Calu-3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig01.jpg"> Figura 1: A estação de exposição automatizada (AES). A figura esquerda mostra o lado de fora do armário com o painel de toque. O AES possui três níveis com módulos de exposição: o nível superior para exposições de ar limpo e o nível médio e inferior para exposições aerossóis. A figura certa mostra o módulo de exposição no qual as pastilhas com células são colocadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática da configuração de exposição. Da esquerda para a direita: 1) a suspensão ENM conectada ao bocal de pulverização através de uma bomba peristáltica; 2) Utilizando ar comprimido o bocal de spray nebuliza a suspensão ENM e através de uma câmara de mistura os aerossóis são levados para o AES; 3) Pouco antes de entrar no AES, os instrumentos de caracterização aerossol estão conectados: SMPS, OPS, CPC e TEOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig03.jpg"> Figura 3: Imagem representativa das células Calu-3 após a colheita na interface ar-líquido (ALI) por 10 dias. Imagem de microscopia de fluorescência de células Calu-3 depois de culminar no ALI por 10 dias. Proteína de junção apertada ZO-1 está manchada de verde, núcleos das células estão manchados em azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig04.jpg"> Figura 4: Resistência elétrica transeptelial (TEER) de quatro linhas celulares diferentes durante um período de cultura de 21 dias. Valores TEER de 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B quando cultivados por 21 dias: primeiros 7 dias submersos, seguidos por 14 dias no ALI. Os valores teer foram corrigidos para a resistência de fundo da pastilha e multiplicados pela área superficial da pastilha. Os símbolos e barras de erro representam o valor médio e o desvio padrão de seis inserções. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig05.jpg"> Figura 5: Liberação LDH de quatro linhas celulares diferentes durante um período de cultura de 21 dias. Versão LDH de 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B quando cultivada por 21 dias: 7 dias submersa, seguida por 14 dias no ALI. Os valores LDH mostrados são relativos à liberação máxima de LDH por tipo de célula. Os símbolos e barras de erro representam o valor médio e o desvio padrão de cinco inserções. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig06.jpg"> Figura 6: Efeitos celulares em células Calu-3 expostas a LPS. As células calu-3 foram expostas via nebulização de nuvens a 0,25 μg/cm2 LPS. (A) A conversão WST-1. (B) Liberação LDH. (C) TNF-α lançamento após a exposição lps. Os símbolos e barras de erro representam valores médios e desvios padrão de três inserções. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig07.jpg"> Figura 7: Efeitos celulares em células Calu-3 expostas a nanomateriais DQ12. As células calu-3 foram expostas por 3 semanas (4h por dia, 5 dias por semana) a nanomateriais DQ12, cerca de 120 ng/cm2 por dia, dose acumulada de 1,6 μg/cm2. (A) Valores TEER. (B) Liberação LDH. (C) Liberação do MCP-1 após a exposição ao DQ12. Todos os símbolos e barras de erro representam valores médios e desvios padrão de três inserções para os controles e seis inserções para a exposição dQ12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig08.jpg"> Figura 8: Reatividade Acelular do DQ12. O DQ12 foi incubado com uma sonda diacetato de 20,70-Dicclorofluorescein (DCFH-DA) para detectar sua reatividade superficial. Como controle positivo, foram incluídas partículas pretas de carbono (CB). Comparado ao CB, o DQ12 tem reatividade superficial muito baixa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Massa de partículas (μg/m3)</td>
			<td>Número de partículas (#/cm3)</td>
			<td>Tamanho da partícula de mobilidade (nm)</td>
			<td>Desvio padrão geométrico</td>
			<td>Tamanho de partícula óptica (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2969 (418)</td>
			<td>83983 (10215)</td>
			<td>66.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.1 (1.3)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Características de exposição do DQ12. Os valores são mostrados como médios com desvio padrão entre parênteses.

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An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.

Um modelo epitelial de interface ar-líquido para exposição de inalação realista e repetida a partículas aéreas para testes de toxicidade

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

an-air-liquid-interface-bronchial-epithelial-model-for-realistic

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K visualizações.  National Institute for Public Health and the Environment (RIVM). Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.

Vídeo: An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Teste de tolerância à nicotina em Aphids Usando uma experiência Dieta Artificial

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Biologia

Using an EEG-Based Brain-Computer Interface for Virtual Cursor Movement with BCI2000

A brain-computer interface (BCI) functions by translating a neural signal, such as the electroencephalogram (EEG), into a signal that can be used to control a computer or other device. The amplitude of the EEG signals in selected frequency bins are measured and translated into a device command, in this case the horizontal and vertical velocity of a computer cursor. First, the EEG electrodes are applied to the user s scalp using a cap to record brain activity. Next, a calibration procedure is used to find the EEG electrodes and features that the user will learn to voluntarily modulate to use the BCI. In humans, the power in the mu (8-12 Hz) and beta (18-28 Hz) frequency bands decrease in amplitude during a real or imagined movement. These changes can be detected in the EEG in real-time, and used to control a BCI ([1],[2]). Therefore, during a screening test, the user is asked to make several different imagined movements with their hands and feet to determine the unique EEG features that change with the imagined movements. The results from this calibration will show the best channels to use, which are configured so that amplitude changes in the mu and beta frequency bands move the cursor either horizontally or vertically. In this experiment, the general purpose BCI system BCI2000 is used to control signal acquisition, signal processing, and feedback to the user [3].

In this video, we demonstrate the steps required to run a brain-computer interface experiment, including setting up the EEG cap, calibrating the system, and training the user to move a cursor in two dimensions using imagined movements.

Usando um EEG-Based Interface Cérebro-Computador para Movimento do Cursor Virtual com BCI2000

A brain-computer interface (BCI) functions by translating a neural signal, such as the electroencephalogram (EEG), into a signal that can be used to ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Todo o corpo de nanopartículas de aerossóis exposições por inalação

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedimento para avaliar a eficiência de floculantes para a Remoção de partículas dispersas de extractos de plantas

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocolo experimental para o uso de drosófila como um sistema modelo invertebrados para testes de toxicidade em laboratório

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...