Este protocolo facilita a preparação e administração de um coquetel viral e phage contra pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma avaliação in vivo da eficácia da praga no combate à infecção bacteriana. O coquetel de phage é eficiente tanto no tipo selvagem quanto nos modelos de zebrafish de fibrose cística.
Abrindo a possibilidade de aplicar a terapia de phage a infecções bacterianas em pacientes com fibrose cística. A terapia phage também pode ser aplicada para neutralizar infecções bacterianas específicas em outros sistemas modelo. Para preparar um estoque de phage para o experimento.
Adicione 1,25 vezes 10 ao sétimo phages a uma cultura OD 600 de 0,05 P.aeruginosa a uma multiplicidade de infecção de uma vezes 10 para os três negativos e incubar a cultura por três a quatro horas com agitação até que o OD 600 caia para 0,1 a 0,3. No final da incubação incubar o lysate com um micrograma por mililitro de DNAse e RNAse por 30 minutos a 37 graus Celsius. E pelotar as células por centrifugação.
No final do filtro de centrifugação o supernascer através de um diâmetro de poros de 0,8 micro metros e adicionar 58 gramas por litro de cloreto de sódio e 105 gramas por litro de PEG 6000. Incubar a solução a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, precipitar a praga por centrifugação.
No final da centrofugação remova o supernascer e dissolva cuidadosamente a pelota de phage em 15 mililitros de tampão de cloreto de sódio Tris. Para purificar as pragas por gradiente de densidade de cloreto de césio, primeiro estratifique dois mililitros de quatro soluções diferentes de cloreto de césio em tubos de ultracentrífugo politomérico para um Rotor SW 41 e adicione 3,5 mililitros da suspensão de phage a cada tubo. Cloreto de césio é tóxico.
Adote sempre os procedimentos de segurança adequados ao manusear e descartar este composto. Quando todos os tubos estiverem carregados, coloque os tubos no rotor, tomando cuidado para que os tubos estejam equilibrados. E centrifugar as amostras por duas horas a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius.
No final da centrifugação, use uma seringa com uma agulha de calibre 19 para aspirar a camada branca entre o D é igual a 1,5 e o D equivale a 1,4 regiões de densidade. E transfira as suspensões para novos tubos de poliallômero tamanho SW 60. Centrifugar as suspensões por pelo menos 16 horas a 150.000 vezes g e quatro graus Celsius.
E transfira as bandas visíveis para tubos de diálise com um corte de 6.000 Dalton. Em seguida, dilímpe as amostras coletadas duas vezes contra 500 mililitros de água por 20 minutos por diálise e durante a noite contra 500 mililitros de tampão de cloreto de sódio tris. Na manhã seguinte, filtre o estoque de phage resultante com um filtro de poros de 0,22 mímetro e armazene o estoque a quatro graus Celsius.
No dia da micro injeção dilui duas soluções de estoque de morfolinos micromolar em água estéril a uma concentração final de 0,25 picomolar por embrião para obter uma solução de injeção de morfolino de cinco microliter. E adicione 0,5 microliters de fenol vermelho a cada solução. Em seguida, use uma micropipette de 20 microliteres com uma ponta de carregamento de gel fino para carregar uma agulha de micro injeção com todo o volume de solução mista de morfolino e fixar a agulha a um micromistor conectado a um suporte sob um microscópio estéreo.
Em seguida, com uma ou duas células, embriões de peixe zebra dispostos em um slide de vidro colocado dentro de uma placa de Petri de 96 milímetros de diâmetro, penetram o acorde e a gema com a ponta da agulha de micro injeção e injetam dois nanoliters da mistura de morfina no embrião. Às 26 horas após a fertilização, carregue uma agulha de micro injeção com aproximadamente cinco microliters de P.aeruginosa inoculum e insira a agulha dorsalmente até o ponto de partida do ducto de Cuvier no qual o duto começa a se espalhar sobre o saco de gema. Injete um a três nanoliters do inóculo PAO1 no embrião certificando-se de que o volume se expanda diretamente dentro do duto e entre na circulação.
Após a injeção transfira o embrião para uma das duas novas placas de Petri contendo e3 médio fresco suplementado com fenilhiourea por uma incubação de 30 minutos ou três horas a 28 graus Celsius. Em seguida, carregue uma agulha de micro injeção com aproximadamente cinco microliters do coquetel de phage e fixe a agulha no micro injetor. Em seguida, injete um a três nanoliters de coquetel de phage no duto de Cuvier de cada embrião previamente injetado com bactérias e coloque os embriões em uma das duas novas placas de Petri contendo e3 médio fresco suplementado com fenilhiourea a 28 graus Celsius.
Às quatro horas após a infecção, use uma pipeta plástica para transferir um embrião anestesiado em um prato de fundo de vidro. E encha o prato com ponto de fusão baixo quente agarose solução. Quando a agarose estiver fria, encha suavemente o prato com e3 médio suplementado com solução anestéstica.
Coloque o prato sob o microscópio estéreo e use uma ponta de pipeta para posicionar o embrião na orientação desejada. Em seguida, coloque o prato sob um microscópio estéreo fluorescente com um filtro fluorescente para bactérias positivas GFP por até 18 horas após a infecção e imagem do embrião para a progressão da expressão GFP aos nove, 14 e 18 horas pós-infecção. Para determinar a carga bacteriana em oito horas após a infecção, transfira 15 embriões micro-injetados anestinados em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e substitua a solução anestésica por 300 microlitres de 1%Triton X-100 em PBS.
Passe as agulhas através da agulha estéril de 27 medidores de uma seringa de insulina pelo menos 15 vezes para homogeneizar os embriões. E preparar diluições seriais do homogeneizar transferindo 100 microliters da mistura resultante em 900 microliters de PBS estéril por diluição. Para selecionar para a cepa P.aeruginosa naturalmente resistente à anicilina, placa 10 microliters das diluições em ágar LB suplementado com ampicillina e incuba-los durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, conte o número de colônias. Para permitir o cálculo do número total de unidades formadoras de colônias e o número médio de colônias formando unidades por embrião infectado. Para avaliar a letalidade da infecção por P.aeruginosa, os embriões injetados em 20 horas após a infecção sob um microscópio estéreo contam o número de embriões brancos mortos opacos.
Em seguida, calcule a concentração letal meia máxima 50 dose de P.aeruginosa que resultou na morte de 50% dos embriões injetados em 20 horas após a infecção. Para validar o fenótipo da fibrose cística, a posição prejudicada de órgãos internos como o fígado cardíaco e o pâncreas podem ser avaliadas. A carga bacteriana é reduzida pela terapia de phage em embriões de fibrose cística infectados com P.Aeruginosa.
Em 48 horas após a fertilização, embriões de fibrose cística infectados com bactérias P.Aeroginosa positivas da GFP, uma colônia formando unidades por dose de embrião demonstra uma letalidade de 50% em 20 horas após a infecção. A terapia de phage é igualmente eficaz em 20 horas após a infecção quando entregue 30 minutos ou sete horas após a injeção bacteriana. Aqui, uma fibrose cística e P.Aeruginosa positiva da GFP injetaram embrião em quatro, nove, 14 e 18 horas após a infecção.
Em contraste, a fibrose cística mais P.Aeruginosa mais o embrião injetado por phage demonstra uma fluorescência reduzida devido à ação de phage contra as bactérias. A resposta inflamatória gerada pela infecção por P.aeruginosa em embriões de fibrose cística é significativamente aumentada, conforme revelado pela expressão das citocinas pró-inflamatórias, TNF alfa e interleucina 1 beta após injeção de P.aeruginosa em comparação com o controle de zebrafish injetado. No entanto, a expressão de ambas as citocinas inflamatórias é reduzida em animais co-injetados no coquetel phage.
As pragas devem ser cuidadosamente purificadas para remover qualquer endotoxina contaminante que possa ser retida durante a preparação. As preparações de phage podem ser analisadas por microscopia eletrônica para avaliar a morfologia da virion. Seria interessante testar se a infecção em pacientes humanos por bactérias que não sejam pseudomonas aeruginosa pode ser curada com a terapia de phage no modelo de zebrafish fibrose cística.
