1. Montagem do sistema de células de fluxo com todos os componentes O sistema de fluxo montado inclui: tubos de autoclave, armadilhas bolha, médio / frasco de resíduos e células de fluxo, como mostrado na Figura 1. Todas estas peças podem ser reutilizados entre experimentos. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. O fluxo de configuração do sistema de células (componentes essenciais da configuração). O sistema de célula de fluxo é composto por vários componentes: uma garrafa média, uma bomba peristáltica, armadilhas bolha, a célula de fluxo, uma garrafa de resíduos, e diversas seções de tubos interligados por vários conectores. Figura gentilmente cedidas por Rune Lyngklip. 2. Assembleia da Célula de Fluxo <ol><li> A célula de fluxo (Figura 2a) é tratada com faixas finas de cola de silicone, usando uma seringa (Figura 3). </li><li> Coloque uma lamínula em cima das linhas de silicone (Figura 3). Lamínulas de vidro são utilizados como substrato para P. aeruginosa, enquanto lamínulas PVC são aplicados para S. biofilme cerevisiae. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Desenho esquemático da célula de fluxo eo borbulhador 2. Descrição detalhada das dimensões utilizadas para a produção de a) borbulhador fluxo de células b), DTU Biologia de Sistemas. Reproduzido com permissão de John Wiley &amp;, Sons Inc. (DTU Biologia de Sistemas estava anteriormente autorizado Biocentrum, conforme ilustrado na figura) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ilustração do silicone linhas aplicação de cola para a montagem do substrato de vidro. O vidro da tampa indicada é colocada sobre a cola de silicone para anexá-lo à célula de fluxo. <ol start="3"><li> Vire a célula de fluxo e coloque-o sobre uma superfície plana com o lado da lamínula para baixo. Pressione suavemente a parte de trás da célula de fluxo para empurrar a lamínula sobre a base da célula de fluxo. Vire a célula de fluxo mais e inspecionar áreas que não são selados pelo silicone. A alça parte (pistão) de uma seringa pode ser usado como uma ferramenta para pressionar cuidadosamente o celular de vidro e fluxo juntos. </li></ol> 3. Garrafa médio <ol><li> Coloque um tubo de silicone de alimentação (2 mm de diâmetro interno) em um frasco médio e inserir um conector reto na outra extremidade. </li><li> Adicionar médio para a garrafa (para conteúdo médio ver &quot;media&quot; parágrafo) Tampa do conector e uma garrafa com folha de metal e autoclave o meio. Certifique-se que a extremidade do tubo de alimentação é fixado acima do nível do líquido no frasco médio ou um efeito de sifão pode esvaziar a garrafa médio quando autoclave. </li></ol> 4. Conectando a Bolha Armadilha célula de fluxo, e Bomba Montar toda a tubulação de acordo com o esboço na Figura 1. Use tubos de silicone com excepção da parte que atravessa a bomba peristáltica, onde tubos Marprene é aplicada. <ol><li> , A fim de ligar o tubo do frasco de médio a todas as câmaras de fluxo individual, dividir um tubo para o número necessário de entradas aplicada no experimento. Use T-conectores para tornar o número desejável de tubos de conexão do tubo de alimentação para os tubos de Marprene na bomba (ver Figura 1, T-conector). É geralmente uma boa idéia para manter a ordem mesma seqüência de tubos e células de fluxo em todo o sistema, para facilitar a identificação dos componentes em caso de falhas no sistema. </li><li> Conectar cada tubo de alimentação individual (2 mm de diâmetro) para Marprene tubos na bomba usando conectores retos. Conecte o tubo Marprene a um borbulhador (Figura 2b), através de tubo de silicone intermediários (1 mm de diâmetro). Certifique-se que a bomba está ligado à entrada na parte mais alta do borbulhador. </li><li> Conecte o tubo de saída resultantes das armadilhas bolha para a entrada de célula de fluxo (1 mm de diâmetro), certifique-se que o comprimento desses tubos permite que a célula de fluxo para ser transferido para o estágio do microscópio confocal (geralmente 1 m). </li><li> Colocar 5 mL de seringas em cima das armadilhas da bolha. Fechar os topos com tampas adequadas. </li><li> Na saída da célula de fluxo conectar um curta, um pedaço de aproximadamente 40 milímetros de (1 mm de diâmetro), tubos e usar uma &quot;redução&quot; conector em linha reta para prender um tubo de resíduos (2 mm de diâmetro) de comprimento necessário. Coloque os tubos de resíduos no contentor de resíduos. </li><li> Importante, o recipiente de resíduos deve ser sempre colocado no mesmo nível que as células de fluxo, nunca abaixo de célula de fluxo nível. Além disso, certifique-se que o fim do tubo de resíduos é fixado acima do nível esperado de resíduos líquidos para evitar flush-costas devido a um efeito de sifão ao manusear as células de fluxo. </li></ol> 5. Esterilização e lavagem do SISTEMA DE FLUXO <ol><li> Retire as tampas borbulhador e colocá-los em etanol 70% para mantê-las estéreis. </li><li> Executar na velocidade mais alta da bomba para encher o sistema com 0,5% (v / v) de hipoclorito de sódio na água. &lt;/ Li&gt; <li> Coloque as tampas borbulhador para trás, quando as armadilhas bolha estão completamente preenchidos. </li><li> Toque as células de fluxo para remover as bolhas na câmara de fluxo. Tome cuidado para não danificar a tampa de vidro frágil. </li><li> Permitir que o sistema para esterilizar para h 04/03 a uma vazão de 3 mL / h / canal (0,2 mm / s taxa de fluxo linear). </li><li> Lavar o sistema 2-3 vezes para lavar todas as hipoclorito. Encher e esvaziar o sistema com água estéril. Armadilhas bolha deve ser esvaziado completamente entre cada lavagem. Isto pode ser feito através de bombeamento no ar, até armadilhas bolha foram esvaziados. Depois de esvaziar, remova as tampas das armadilhas bolha antes de reencher o sistema. Recoloque as tampas após a bolha armadilhas foram completamente cheio de líquido. Repita conforme necessário. </li><li> Run água estéril através do sistema a um fluxo baixo (1-3 mL / h / canal) durante a noite ou prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Conecte a garrafa de meio para a entrada e lave o sistema com o meio durante a noite com baixa taxa de fluxo (3 mL / h / canal) à temperatura onde o experimento será executado. Nota: armadilhas bolha deve ser esvaziada por água antes que o sistema é preenchido com o meio. </li></ol> 6. Inoculação de célula de fluxo <ol><li> De uma cultura de noite fazer uma diluição para uma densidade óptica desejada (por P. aeruginosa por exemplo, 0,001 OD 600nm e 0,1 OD 600nm de S. cerevisiae). </li><li> Use uma seringa de 0,5 ml com uma agulha de 27G para carregar inóculo suficiente para encher a câmara. 250 L é suficiente para as câmaras de fluxo com as dimensões especificadas neste trabalho (Figura 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Pare a bomba peristáltica. </li><li> Grampo fora do tubo de silicone conduz à célula de fluxo para evitar o refluxo no sistema. </li><li> Esterilizar o local da inoculação sobre o tubo de silicone, limpando-a com álcool 70%. </li><li> Inserir a agulha no tubo de silicone e introduzir a ponta na entrada da célula de fluxo. Injecte lentamente o inóculo para a câmara (ter cuidado para não injetar bolhas de ar). </li><li> Remova a agulha e limpe o local da injecção com etanol 70% seguido de imediata selagem do furo usando cola de silicone sobre o local da injeção. </li><li> Vire a célula de fluxo e deixe os micro-organismos aderem ao substrato por 1 hora sem fluxo através da célula de fluxo. </li><li> Vire a célula de fluxo, ligar a bomba de médio (3 mL / h / canal) e tirar a braçadeira fora do tubo de silicone. </li><li> O sistema é colocado para incubação, a 37 ° C no caso de P. aeruginosa e 30 ° C no caso de S. cerevisiae. </li><li> Biofilme nas câmaras de fluxo pode agora ser visualizado por CLSM. </li></ol> 7. COLORAÇÃO de biofilme para Microscopia <ol><li> Fazer uma diluição da coloração adequada (por exemplo 1:1000 Syto 9 ao vivo mancha de S. cerevisiae) </li><li> Pare a bomba peristáltica. </li><li> Braçadeira do tubo de silicone conduz à célula de fluxo. </li><li> Esterilizar local de inoculação sobre o tubo de silicone, limpando-a com álcool 70%. </li><li> Use uma seringa de 0,5 ml com uma agulha de 27G para carregar solução corante suficiente para encher a câmara. 250 L é suficiente para as câmaras de fluxo usados ​​aqui. </li><li> Inserir a agulha no tubo de silicone e introduzir a ponta na entrada da célula de fluxo. Injecte lentamente a solução de coloração para a câmara (ter cuidado para não injetar bolhas). </li><li> Remova a agulha e limpe o local da injecção com etanol 70% seguido de imediata selagem do local de injecção. </li><li> Deixe a célula de fluxo sem fluxo por 15 minutos. </li><li> Tirar a braçadeira e iniciar o fluxo (3 mL / h / canal) </li><li> Aquisição de dados com o CLSM </li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. 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K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. 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J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos demonstrado um sistema de célula de fluxo que representa uma poderosa ferramenta nas investigações biofilme. Combinado com imagens em 3D através de microscopia confocal, o sistema tem uma série de vantagens em comparação com outros métodos de análise de biofilmes microbianos por meio dos mais tradicionais técnicas de microscopia. Este sistema permite a visualização 3D de vida das comunidades biofilme microbiano sem perturbação da comunidade. Microscopia de luz não fornecerá informações detalhadas sobre os nichos do biofilme e enquanto a microscopia eletrônica fornece uma resolução em nanoescala do biofilme, ele não permite que imagens de células vivas. Usando o sistema de canais de fluxo descrito anteriormente elucidado temos a distribuição espacial das células bacterianas sensíveis a vários antibióticos 5-8 (Figura 4), ​​a distribuição de compostos extracelulares, por exemplo, DNA e 11/09, a distribuição de células móveis e não móveis de mesma espécie dentro de uma comunidade bacteriana 4,6,9 (Figura 4c). Nós prevemos que o sistema de célula de fluxo pode ser usado para estudar os aspectos de biofilmes levedura. Esta pode ser a distribuição espaço temporal de biofilme levedura em resposta a fatores ambientais, tais como fungicidas, bem como a identificação de genes envolvidos na formação do biofilme por leveduras. Apesar de levedura não se sabe se diferenciar em células móveis e não móveis, outros aspectos de diversificação biofilme podem ser estudos, tais como a mudança morfológica de levedura para as células e pseudohyphal a mudança de haplóides de células diplóides. Nós mostramos um sistema que respeitar uma série de espécies microbianas e vai trabalhar com várias técnicas de coloração. Uma variedade de sondas de coloração diferente e proteínas fluorescentes, como o GFP, a possibilitar a investigação nicho específico no biofilme em desenvolvimento e é uma ferramenta eficiente para analisar o efeito de agentes antimicrobianos ou outros fatores ambientais. A informação que pode ser adquirida é muito detalhado (Figura 4) e recursos do biofilme pode ser quantificado com programas de computador, tais como COMSTAT 12,13. No geral, o aspecto mais crítico do protocolo é o fato de que é um processo demorado. É também uma limitação de que as células precisam ser capazes de crescer em uma superfície não fluorescente, transparente. . Desde a formação de biofilmes é analisada utilizando um microscópio confocal, a profundidade que pode ser investigado é limitada a algumas centenas de micrômetros de 14 Há ainda limitações técnicas inerentes ao projeto: o sistema não é adequado para triagem de alto rendimento, como um investigador experiente pode lidar com no máximo cerca de 15 canais por experiência, que por sua vez pode levar vários dias para se preparar. No entanto, antibióticos ou mutantes que são consideradas relevantes para estudos de biofilmes pode ser inicialmente massa rastreados com outros métodos, como a coloração violeta cristal antes de os candidatos mais interessantes são transferidos para o sistema de célula de fluxo. As folhas de cobertura de vidro são muito finos e se quebram facilmente, e cuidados devem ser tomados no manuseio dos sistemas. Além disso, os tubos devem ser examinados diariamente durante a execução de um experimento, como considerável &quot;de volta o crescimento&quot; nos tubos de entrada logo acima das células de fluxo pode ocorrer. Esta contaminação pode ser resolvido através da remoção de vários centímetros de tubo de silicone do lado de entrada das células de fluxo, usando técnica estéril. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 a PAO1) quatro dias de idade -. GFP biofilme tratadas por 24h com Colistina e iodeto de propídio para a coloração de mortos (mancha vermelha) b) apresentação em 3D de um de três dias de idade P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa tipo selvagem) - GFP biofilme 6 c) apresentação 3D imagem de um PAO1 - PCP pila mutante (azul) com um tipo selvagem PAO1 YFP (amarelo) d) 5 dias PAO1 idade - GFP biofilme apresenta-se como um 3D e imagem) 26 h S. biofilme cerevisiae (PTR3 mutante em CEN.PK fundo) corados com Syto-9 15.

<ul><li> Armadilhas bolha, polietileno (DTU Biologia de Sistemas, Universidade Técnica da Dinamarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument% 20Setup.aspx% 20Center/Resources/Biofilm) </li><li> Conectores de plástico transparente de polipropileno e T-conectores (Cole Parmer, 1 / 8 pol (3,175 mm) e 1 / 16 polegadas (1,588 milímetros)) </li><li> Grampos </li><li> Microscópio confocal (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Lamínulas de vidro (Knittel Glaser) 50 x 24 mm </li><li> Lamelas, PVC lamínulas (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Células de fluxo, de polietileno (DTU Biologia de Sistemas, Universidade Técnica da Dinamarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument% 20Setup.aspx% 20Center/Resources/Biofilm </li><li> Garrafas de meio (Schott) </li><li> Bomba peristáltica (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rolando carrinho para sistemas de fluxo e bombas </li><li> Cola de silicone (3M Selante de Silicone Super Clear) </li><li> Seringa de 5 mL (Terumo) </li><li> Syto 9 (Molecular Probes) </li><li> Seringas 0,5 ml com agulha (27G, Terumo LU-100) </li><li> Recipiente para resíduos </li></ul> Tubulação: <ul><li> Silicone, 3 mm de diâmetro externo, 1 mm de diâmetro interno (Ole Dich) </li><li> Silicone, 4 mm de diâmetro externo, 2 mm diâmetro interno (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm de diâmetro exterior, 1 mm de diâmetro interno (Watson-Marlow) </li></ul> Mídia <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa médio </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 mL 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 L / L dos metais traço (por P. aeruginosa-biofilmes) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix A10 e PC em uma proporção de 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar fonte de carbono para uma concentração desejada. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae sintético médio (SC) completa </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Sulfato de adenina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-triptofano </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-histidina-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-arginina-HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-lisina-HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-ácido aspártico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-ácido glutâmico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Levedura Nitrogen base de w / o de aminoácidos e amônia (Bacto) </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> Sulfato de amônio </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Ácido succínico </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glicose (autoclavados separadamente) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

Células microbianas muitos têm a capacidade de formar comunidades microbianas sésseis definido como biofilmes que alteraram as propriedades fisiológicas e patológicas em comparação com microorganismos de vida livre. Biofilmes na natureza são muitas vezes difíceis de investigar e residir sob condições definidas mal 1. Usando um substrato transparente é possível a um dispositivo de sistema onde biofilmes simples podem ser analisados ​​de forma não-destrutiva em tempo real: aqui demonstrar a montagem e operação de um sistema modelo de fluxo de células, para estudos in vitro de biofilmes microbianos em 3D gerando alta reprodutibilidade sob condições bem definidas 2,3. O sistema consiste de uma célula de fluxo, que serve como câmara de crescimento para o biofilme. A célula de fluxo é fornecido com nutrientes e oxigênio a partir de um frasco médio através de uma bomba peristáltica e médio gasto é coletada em um recipiente de resíduos. Esta construção do sistema de fluxo permite um fornecimento contínuo de nutrientes e administração de antibióticos por exemplo, com o mínimo de perturbação das células cultivadas em câmara de fluxo. Além disso, as condições de fluxo dentro da célula de fluxo permitem estudos de biofilme expostos a tensão de cisalhamento. Uma bolha bolhas de interceptação dispositivo limites de ar da tubulação que de outra forma poderiam perturbar a estrutura do biofilme na célula de fluxo. O sistema de célula de fluxo é compatível com Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM) e pode, assim, fornecer informações altamente detalhadas em 3D sobre o desenvolvimento de biofilmes microbianos. Células no biofilme podem ser rotulados com sondas fluorescentes ou proteínas compatível com a análise CLSM. Este permite a visualização on-line e permite investigação de nichos no desenvolvimento de biofilme. Inter-microbiana, a investigação de agentes antimicrobianos ou a expressão de genes específicos, são muitas das configurações experimentais que podem ser investigadas no sistema de célula de fluxo.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocolo que descreve a aplicação de um sistema de célula de fluxo para o cultivo e análise de biofilmes microbianos para Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e Saccharomyces cerevisiae Biofilme em Células de Fluxo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.5K visualizações.  Danish Technical University. Protocolo que descreve a aplicação de um sistema de célula de fluxo para o cultivo e análise de biofilmes microbianos para Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM).

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Imunologia e Infecção

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Usando Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagênese Mariner Transposon mediada

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replicação do requisitado, biblioteca não redundante de estirpe Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon mutantes de inserção

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...