Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de subvenção GM118085 e em parte pela Fundação Robert Welch (conceder F-1811 a R.M.H.).

1. Isolamento de mutantes supressores em cepas deficientes de motilidade
NOTA: Use este método como um amplo "catch-all" para identificar a natureza geral do defeito de motilidade.
<ol><li>Preparação de placas de ágar macio NOTA: O ágar macio, também chamado de ágar de motilidade ou natação, é um ágar de baixa porcentagem (~0,2-0,35% w/v), muito usado para avaliarquimiotaxis 31,32.<ol>
<li>Adicione 3 g de bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g de LB a um frasco fundo redondo de 2 L. Adicione 1 L de ddH2O (água duplamente destilada) ao frasco e misture uniformemente a suspensão usando uma haste de mexida e placa de agitação magnética.</li>
		<li>Autoclave por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Deixe esfriar com agitação suave usando a haste/placa como acima. Quando a temperatura atingir aproximadamente 50 °C, despeje 25 mL em placas estéreis de Petri (100 mm x 15 mm), e permita que o ágar derretido coloque a tampa no lugar por pelo menos 1h, para uso dentro de 16 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação cultural, inoculação e isolamento de mutantes supressores NOTA: E. coli inoculado no centro de mídia rica em nutrientes solidificada com ágar macio consome nutrientes localmente, criando um gradiente de nutrientes que eles seguem. À medida que se movem para fora, aparecem 'anéis' definidos(Figura 1A), que estão relacionados a quimioattractants específicos a que as bactérias respondem. Defeitos no sistema de quimiotaxis ou componentes estruturais do motor flagela podem comprometer o desempenho neste ensaio. Muitas vezes, mutantes com uma vantagem de motilidade surgem durante a exibição, e podem ser vistos emergindo de um único ou de vários pontos ao longo da periferia do anel, de onde eles 'flare' para fora(Figura 1C). Nota-se que a borda mais externa da frente de natação contrasta prontamente contra o ágar macio virgem não colonizado.<ol>
<li>Cresça culturas noturnas da variedade deficiente de motilidade desejada em 5 mL de Caldo de Lennox (LB; triptona de 10 g/L, extrato de levedura de 5 g/L e 5 g/L NaCl, Tabela de Materiais) a 30 °C com agitação horizontal (220 r.p.m.). No dia seguinte, subcultura (diluição de 1:100) em LB fresco, crescendo sob as mesmas condições para fase exponencial (OD600 de 0,6).</li>
		<li>Inocular 6 μL da cultura no centro de uma placa de ágar macio (1.1) usando uma pipeta, empurrando a ponta estéril carregada para dentro do ágar para expulsar suavemente o conteúdo. Transfira para 30 °C e incubar(Figura 1B),até que as "erupções" de motilidade sejam evidentes, emanando do ponto de inoculação ou da periferia dos anéis de motilidade, tipicamente em 24-36 h(Figura 1C). NOTA: Nos ensaios de motilidade, inocular uma cepa do tipo selvagem ao lado dos isolados mutantes para comparação. Esta cepa de tipo selvagem mostrará os anéis quimotacticos concêntricos característicos(Figura 1A) e encherá a placa dentro de 8-10 h.</li>
		<li>Use um laço de arame estéril para levantar as células da região 'flare' e listras para purificar colônias únicas em uma placa de ágar duro LB (LB preparado como acima, solidificado com 15 g/L bacto-ágar).</li>
		<li>Escolha colônias únicas da placa de raia usando um laço de arame estéril e re purifique, redimensionando-se para colônias únicas para garantir o isolamento de uma colônia "pura".</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmação e caracterização de mutantes supressores
	<ol>
<li>Confirme que os mutantes isolados do supressor restauraram a motilidade. Prepare placas de ágar macio (1.1) e culturas para cepas de interesse (como em 1.2.1), incluindo o tipo selvagem e a tensão inicial "deficiente de motilidade" para comparação.</li>
		<li>Inocular as placas (como em 1.2.2) e incubar a 30 °C por 8-10 h.</li>
		<li>Regissuir o diâmetro do anel mais externo (borda do círculo) e compare para estabelecer qual dos isolados restaurou substancialmente a motilidade. NOTA: Recomenda-se que as placas sejam fotografadas durante todo o período de tempo do experimento. Para obter melhores resultados, use um dispositivo "balde de luz"30,onde uma câmera digital é montada acima de uma fonte de luz para melhor iluminação para medir o diâmetro da colônia de natação e distingui-lo do ágar não colonizado.</li>
		<li>O sujeito verificou isolados para WGS conforme necessário, permitindo uma "cobertura de sequência" suficiente para identificar positivamente as mutações que restauraram a função do tipo selvagem.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantificar o comportamento motor de flagela através da amarração celular
NOTA: Use este método quando o comportamento normal de queda de corrida (quimiotaxis) parece estar comprometido.
<ol><li>
Preparação cultural e flagela tesoura
	<ol>
<li>Prepare uma cultura de fase exponencial da tensão de interesse, conforme descrito na etapa 1.2.1.</li>
		<li>Pelota 10 mL de células por centrifugação a 2.000 x g por 3 minutos antes de reutilizar em 10 mL de tampão de motilidade esterilizado por filtro (MB; Tampão fosfato de potássio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0,1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOTA: MB suporta motilidade, mas não suporta crescimento bacteriano</li>
		<li>Repita o passo 2.1.2 mais duas vezes antes de reutilizar a pelota final em 1 mL de MB.</li>
		<li>Transfira a suspensão da célula para uma seringa de 1 mL e conecte uma agulha 23G até o final. Monte um aparelho de seringa/agulha idêntico e conecte os dois juntos através de 6 polegadas de tubos de polietileno (diâmetro interno de 0,58 mm) firmemente em baia sobre cada ponta de agulha.</li>
		<li>Tesoura a flagela (eles são frágeis e quebram facilmente) passando suavemente a suspensão da célula para frente e para trás de uma seringa para a outra 50x, com 1 min pausas entre cada 10 passes.</li>
		<li>Centrifugar as células desarmadas a 2.000 x g por 3 min e resuspend em um volume final de 500 μL de MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de slides e amarração celular
	<ol>
<li>Prepare uma câmara de fixação celular empilhando uma tampa de 18 mm x 18 mm sobre um slide de microscópio de vidro de 3 polegadas x 1 polegada x 1 mm, separado por fita dupla face(Figura S1).</li>
		<li>Lave a câmara com solução de poli-lise de poli-lise de 0,01% (w/v) aplicando-se ao topo da câmara. Incline a borda inferior (a mancha de cobertura alinhada com o slide do microscópio) em um limpador de tarefas (papel de tecido) para ajudar a desenhar a solução através da câmara(Figura S1). Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
		<li>Lave a câmara três vezes com 40 μL de MB usando como descrito na etapa 2.2.2</li>
		<li>Adicione 40 μL da suspensão da célula de corte (preparada acima) ao topo da câmara e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que as células se conectem ao deslizamento de tampas.</li>
		<li>Lave suavemente a câmara com 40 μL de MB como em 2.2.3 para remover células nãoectadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gravação e quantificação de rotação celular
	<ol>
<li>Transfira o slide do microscópio carregado com células amarradas para o estágio do microscópio.</li>
		<li>Utilizando microscopia de contraste de fase e um objetivo de 100x, escaneie a população em busca de células fixadas no lugar e gire em um único eixo, ou seja, rotações suaves em um ponto fixo em vez de apresentar em um ângulo onde a célula se move dentro e fora de foco(Vídeo 1).</li>
		<li>Use um microscópio comercial e uma câmera associada. Abra o software associado, garanta que as células de interesse estejam em foco e clique na aquisição de vídeo para gravar a rotação do celular por um minuto (a 10 quadros por segundo ou superior).</li>
		<li>A partir da reprodução de vídeo, quantifique o número de rotações completas por minuto e o número de vezes que a célula muda de direção (frequência de comutação). NOTA: As velocidades de rotação e a frequência de comutação podem ser muito rápidas para medir olho por olho, por isso é recomendado usar software de vídeo que ofereça reprodução lenta/fina, ou adote um sistema de software automatizado para quantificar padrões de rotação33. Uma alternativa seria aumentar a viscosidade do MB usando celulose de metila (ou agente similar) para ajudar a retardar e resolver a rotação de bactérias mais rápidas ou compensar quando câmeras com esquadragens baixas estão em uso.</li>
		<li>Repita o passo 2.3.2 com réplicas biológicas para compilar uma representação da população de interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparação de enxames em um ensaio de travessia de fronteiras
NOTA: Use este método para avaliar o impacto de uma mutação ou condição na motilidade do grupo. Swarm-agar refere-se ao ágar onde a porcentagem é tipicamente maior do que a do ágar macio. Em ágar macio (0,3%), as células nadam individualmente dentro do ágar. No ágar enxame (0,5% ou mais), as células se movem como um grupo na superfície. Enquanto as placas de enxame devem ser usadas como detalhadas aqui, as placas de natação têm uma vida útil mais longa, e podem ser usadas por vários dias. Nossa preferência pessoal é usar em 1-2 dias.
<ol><li>
Preparação do enxame ágar
	<ol>
<li>Adicione 5 g de agar Eiken (0,5% c/v) e 20 g de LB a um frasco fundo redondo de 2 L. Adicione 1 L de ddH2O ao frasco e misture uniformemente a suspensão usando uma haste de mexida e placa de agitação magnética.</li>
		<li>Autoclave por 20 min a 121 °C.</li>
		<li>Deixe esfriar com agitação suave para evitar quaisquer bolhas de ar usando a haste/placa como acima. Quando aproximadamente 50 °C, adicione glicose esterilizada por filtro para uma concentração final de 0,5 %.</li>
		<li>Despeje 25 mL em placas de Petri estéreis (100 mm x 15 mm) e deixe fixar em temperatura ambiente por pelo menos 14 h e não mais do que 20 h. Não guarde para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inoculação e incubação de placas de enxame
	<ol>
<li>Inocular 6 μL de uma cultura exponencial média (preparada como em 1,2) ao detectar em cima do ágar.</li>
		<li>Deixe a tampa desligada por 5-10 min e substitua quando o inóculo secar na superfície do ágar.</li>
		<li>Incubar a 30 °C por 8 h. Evite a tentação de inspecionar o progresso do enxame removendo a tampa, pois isso contribuirá para a secagem do ágar e prejudicará o enxame. NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo do fenótipo da cepa. Algumas mutações isoladas podem dificultar a capacidade de enxame e exigirão uma porcentagem reduzida de ágar ou um período mais prolongado de incubação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elaboração de placas de ensaio de travessia de fronteira NOTA: Este ensaio utiliza uma placa de Petri modificada, onde uma divisão de plástico (borda) cria duas câmaras, em vez de uma(Figura 2A). Cada câmara pode ser preparada independentemente da outra, oferecendo condições diferentes para enxame, antes de "conectar" as duas. Dependendo do design experimental, a primeira câmara (designada à esquerda) pode ser preparada com ágar nadador (0,3% c/v) ou ágar enxame (0,5% c/v) de onde as bactérias podem migrar através da fronteira para a câmara direita contendo ágar enxame +/- qualquer suplemento ou desafio necessário (por exemplo, antibióticos). A migração em ambos os ágars é tipicamente medida/comparada registrando o diâmetro mais amplo da colonização bacteriana (borda a borda) do ponto original da inoculação.<ol>
<li>Prepare o ágar de natação, conforme descrito em 1.1, se necessário.</li>
		<li>Prepare o ágar do enxame, como descrito em 3.1.</li>
		<li>Despeje ~30 mL de ágar enxame (com suplementação desejada, se necessário) na câmara direita de uma placa de Petri de compartimento duplo (100 mm x 15 mm), ao ponto em que está nivelado com o divisor de plástico entre as câmaras, mas não transbordando para a esquerda(Figura 2B).</li>
		<li>Depois que o ágar endurecer, encha a câmara esquerda com ~30 mL de natação ou ágar enxame, novamente ao ponto de contato com a divisão de plástico(Figura 2C). Antes de definir, use uma ponta de pipeta estéril para arrastar suavemente o ágar sobre a borda para conectar os dois lados com uma ponte de ágar de ~1 mm de altura que abrange toda a extensão da divisão(Figura 2D).</li>
		<li>Deixe a placa secar à temperatura ambiente (3.1). NOTA: Um método alternativo de criação de ponte é permitir que o ágar da câmara esquerda seque e, em seguida, lentamente pipeta ~100 μL de ágar enxame derretido ao longo do divisor de plástico para fazer a ponte das duas câmaras (3.4). Inocular as placas na câmara esquerda como detalhada acima para natação (1.2.2) ou enxame (3.2) ágar, antes de incubar a 30 °C por 12-16 h, ou até que enxames tenham feito progresso suficiente sobre a câmara direita para permitir comparações entre cepas de interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O isolamento e a caracterização das mutações supressoras contribuíram com sucesso para identificar componentes-chave do sistema de quimioterapia35,36,37, bem como da própria máquina motora38,39,40. Ao usar o Protocolo 1, é importante incluir múltiplas réplicas independentes para garantir o isolamento de um grande espectro de p...

As bactérias empregam muitos apêndices para movimentação e dispersão em seus nichos ecológicos1. A motilidade conduzida por Flagella é a mais rápida delas, promovendo a colonização de locais favoráveis em resposta aos sinais ambientais, contribuindo significativamente para a capacidade patogênica de algumas espécies2,3. Bactérias flageladas podem nadar individualmente em líquido a granel, ou enxame como um coletivo sobre uma superfície semissólida4. A flagela extracelular se prende e é conduzida por motores rotativos embutidos na membrana, que aproveitam a potência dos gradientes de íons para gerar torque que causa rotação1,2,4,5,6,7,8. Em E. coli, cujos motores funcionam em um torque constante9, a saída do motor pode ser categorizada em termos de velocidade rotacional e comutação do rotor entre as direções no sentido anti-horário (CCW) e sentido horário (CW). A rotação CCW promove a formação de um feixe de flagelar coerente que impulsiona a célula para a frente (corrida), enquanto um interruptor transitório na direção rotacional (CW) faz com que o feixe se desmonte parcial ou totalmente10, e a célula reoriente sua direção de natação (tombo). E. coli normalmente corre por um segundo e cai por um décimo de segundo. A frequência de comutação do rotor ou do "viés de queda" é controlada pelo sistema de sinalização de quimiotaxis, onde os quimoreceptores transmembrano detectam sinais químicos externos e transmitem-nos via fosfora ao motor flagelador para estender as corridas em resposta aos atrativos, ou suprimi-los em resposta a produtos químicos tóxicos11,12. A motilidade da natação é avaliada em 0,3% de ágar macio.
Durante o enxame, as bactérias navegam em uma superfície semissólida como um coletivo denso, onde pacotes de bactérias fluem em um movimento contínuo de redemoinho2,13,14,15. Os enxames de E. coli apresentam fisiologia quimioensory alterada (viés de queda mais baixo), maiores velocidades e maior tolerância a antimicrobianos sobre células que nadam em líquido a granel16,17. Os enxames variam em sua implantação de uma infinidade de estratégias que auxiliam o movimento, incluindo produção surfactante, hiperflagellação e alongamento celular2. O swarming oferece às bactérias uma vantagem competitiva nos ambientes ecológicos e clínicos18,19,20. Existem duas categorias de bactérias em enxame: enxames temperados, que só podem enxamear na mídia solidificada com 0,5-0,8% de ágar, e enxames robustos, que podem navegar através de concentrações de ágar mais altas21.
Existem uma variedade de ensaios para interrogar a motilidade da natação e sua regulamentação. Quando prejudicada por mutações ou condições ambientais, a própria motilidade oferece uma forte seleção para identificar mutações supressoras de ganho de função. Esses supressores podem ser revertentes genuínos da mutação original, ou pseudo-revertentes, onde uma segunda mutação restaura a funcionalidade. Tais mutantes podem ser identificados por sequenciamento de genomas inteiros (WGS). Uma alternativa à seleção de supressores imparcial é uma estratégia de mutagênese direcionada tendenciosa (por exemplo, mutagênese PCR). Essas metodologias muitas vezes lançam luz sobre a função ou regulação ambiental do aparelho de motilidade. Se o objetivo é estudar a função motora, então a restauração da motilidade do tipo selvagem medida em ágar macio pode não necessariamente indicar a restauração da saída do motor do tipo selvagem. O ensaio de amarração celular, no qual as células são anexadas a uma superfície de vidro por um único flagellum e a rotação do corpo celular é posteriormente monitorada, pode ser o ensaio inicial de escolha para avaliar o comportamento motor. Embora metodologias mais sofisticadas estejam agora disponíveis para monitorar as propriedades do motor, a configuração necessária da câmera de alta velocidade e a aplicação de pacotes de software para análise de movimento limitam seu uso generalizado22,23,24,25. O ensaio de amarração da célula requer apenas que a flagela seja amarrada, permitindo a fixação dos filamentos curtos a um slide de vidro, seguido de filmagem da rotação do corpo celular. Embora as velocidades motoras registradas sejam baixas neste ensaio devido à alta carga que o corpo celular exerce sobre o flagelo, este ensaio contribuiu, no entanto, para insights valiosos sobre as respostas chemotactic26,27,28,29, e continua sendo uma ferramenta investigativa válida como discutido abaixo.
A motilidade repleta representa um conjunto diferente de desafios para os pesquisadores. A seleção de supressores de ganho de função só funciona em enxames que produzem surfactantes abundantes e enxames prontamente13. Não-produtores surfactantes como o E. coli são exigentes com relação à escolha do ágar, composição da mídia e umidade do ambiente2,13,14,21. Uma vez estabelecidas as condições de enxame, o ensaio de travessia de fronteiras17 é uma metodologia útil para interrogar a capacidade de um enxame de navegar em novas/condições duras. Embora os protocolos apresentados abaixo se relacionem com E. coli,eles podem ser prontamente adaptados para aplicação em outras espécies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

A motilidade é crucial para a sobrevivência e o sucesso de muitas espécies bacterianas. Existem muitas metodologias para explorar a motilidade para entender caminhos de sinalização, para elucidar a função e montagem de partes flageladoras, e para examinar e entender padrões de movimento. Aqui demonstramos uma combinação de três dessas metodologias. A motilidade no ágar macio é a mais antiga, oferecendo uma forte seleção para isolar mutações supressoras de ganho de função em cepas prejudicadas pela motilidade, onde a motilidade é restaurada através de uma segunda mutação. A técnica de amarração celular, primeiramente empregada para demonstrar a natureza rotativa do motor flagelador, pode ser usada para avaliar o impacto dos efeitos de sinalização na velocidade do motor e sua capacidade de alternar a direção rotacional. O ensaio de "travessia de fronteiras" é mais recente, onde bactérias nadando podem ser preparadas para a transição para se mover coletivamente como um enxame. Em combinação, esses protocolos representam uma abordagem sistemática e poderosa para identificar componentes da maquinaria de motilidade, e para caracterizar seu papel em diferentes facetas da natação e do enxame. Eles podem ser facilmente adaptados para estudar motilidade em outras espécies bacterianas.

O isolamento de pseudo-revertentes em uma cepa de E. coli cuja motilidade é prejudicada por altos níveis da molécula de sinalização c-di-GMP, foi detalhado em trabalhos recentes do nosso laboratório34. Esta cepa (JP1442) abrigava duas mutações: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH é o fosfodiesterase mais ativo que degrada c-di-GMP em E. coli. A ausência de YhjH leva a níveis elevados de c-di-GMP e inibição da motilidade. YcgR é um efeito c-di-GMP. Em complexo co...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.4K visualizações.  The University of Texas at Austin. Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Vídeo: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biologia

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolos para implementação de uma<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação