Este trabalho foi financiado por fundos da Fundação Canadense para Inovação, Canadá Genoma, do Instituto de Genômica de Ontário, o Ministério de Ontário, da Inovação e do Canadian Institutes of Health Research subvenção para JG e AE O E. Vermelha expressando coli DY330 foi um presente tipo de Donald L. Tribunal de Justiça (Instituto Nacional do Câncer, Frederick, MD).

1. Construção de Gene-específico SPA-marcação em E. Strain coli DY330 <ol><li> O plasmídeo pJL148 compreendendo a sequência de DNA SPA-tag e o cassete de canamicina marcador de resistência aos antibióticos (Kan R) são usadas como um modelo na reacção de polimerização em cadeia (PCR) 7. A 45 nt iniciador específico do gene para a frente, localizado imediatamente a montante do codão de paragem do gene alvo em enquadramento com um 27 (&#39;5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) iniciador tag pb específica para a frente, e a 45 nt de primer reverso específico do gene, localizado imediatamente a jusante do codão de paragem do gene alvo, em moldura com uma pe 27 (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) tag primer reverso específico, são usados ​​para ampliar o SPA-tag e Kan R a partir da cassete de pJL148 utilizando as seguintes condições de ciclos de PCR: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 2 min 10 s, seguido de 68 ° C durante 10 min. Essas seqüências amplificadas servir a ums substratos para a maquinaria de recombinação ectópica introduzido λ-Red homólogas (ver abaixo). </li><li> O produto da PCR é purificado usando um kit de purificação Qiaquick PCR, para remover os sais que podem interferir com a electroporação. O produto purificado PCR é subsequentemente dirigida para integrar na extremidade 3 &#39;(, imediatamente a montante do codão de terminação nativo) de um gene específico em DY330 estirpe em que o λ-Red maquinaria de recombinação é expressa 10. </li><li> A estirpe λ DY330-Red expressar é crescida durante a noite em 2 ml de meio Luria-Bertani (LB) a 32 ° C mediante agitação a 180 rpm. 1 ml da cultura durante a noite é posteriormente inoculada em 70 ml de meio LB fresco no frasco de 500 ml. O inóculo é cultivada a 32 ° C mediante agitação a 180 rpm até que a DO600 atinge ~ 0.8. </li><li> A cultura é transferida para um novo balão de 250 ml, em que as células são induzidas através da incubação do balão num banho de água a 42 ° C agitando suavemente ao180 rpm durante 15 min. Imediatamente após a indução, o frasco é incubado num banho de lama de gelo e água durante pelo menos 30 min com agitação. </li><li> A cultura gelada é imediatamente transferida para um pré-refrigerada tubo de polipropileno de 50 ml e submetida a centrifugação a 3993 xg durante 6 min a 4 ° C. O sedimento de células foi ressuspenso em 50 ml de água gelada estéril e centrifugada mais uma vez em 3993 xg durante 6 min a 4 ° C. O sedimento de células foi então ressuspenso em 1 ml de água fria e transferido para um tubo de 1,5 ml Effendorf, e centrifugado à velocidade máxima durante 20 segundos a 4 ° C. Após dois ou três passos de lavagem com água gelada, o sedimento de células foi ressuspenso em 700 ul finalmente de água gelada estéril, resultando em células electro-competentes. </li><li> Através de electroporação, um ul do fragmento amplificado purificada é introduzida em 40 ul de células eletro-competentes. As células são electroporados em um GenePulser da Bio-Rad II, com os seguintes ajustes: 2,5 kV, 25 uF com pulsocontrolador de 200 Ω. Após a recombinação homóloga e de integração, os transformantes que recombinados com êxito a etiqueta / fita no cromossoma são seleccionados com base na resistência ao Kan (Figura 1A). Transformantes múltiplos são selecionados para Western blot para verificar a geração correta (ou seja, sinal positivo) de Spa-marcadas proteínas de fusão com o anticorpo anti-FLAG M2 que é seletiva contra os epítopos bandeira do SPA-tag. </li><li> Confirmado carboxi terminal de tensão de fusão SPA-tag é cultivado em larga escala para isolar complexos proteína solúvel a partir de células colhidas usando o protocolo de purificação SPA. A descrição das etapas envolvidas no procedimento de purificação por afinidade de etiquetas é mostrada na Figura 1B. </li></ol> 2. Cultura e Sonication <ol><li> Inocular 100 ul de uma E. SPA-tagged coli estoque de glicerol em 50 ml de caldo óptimo (TB) meio líquido suplementado com 50 ul de 25 ug / ml of Kan solução num balão cónico de 250 ml. Fazer crescer a cultura durante a noite a 32 ° C. Observação: Uma vez que a cassete de λ temperatura induzível Vermelho na estirpe DY330 está sob o controlo de um repressor sensível à temperatura 10, o SPA-tagged estirpe de E. coli é cultivada a 32 ° C. </li><li> Transferem-se 10 ml da cultura durante a noite em 990 ml de TB fresco suplementado com 25 ug / ml de Kan num frasco de 4 litros. A cultura é cultivada a 32 ° C com agitação constante a 250 rpm, durante 5 a 6 horas, até que a DO600 atinge a ~ 2-3. </li><li> Transferir a E. 1 litro coli cultura SPA-tag para limpar garrafas de centrifugação e centrifugar as células a 4 ° C em Beckman J6-HC centrífuga @ 3993 xg durante 15 min. </li><li> O sobrenadante é removido a partir dos frascos de centrifugação. Ressuspender o E. coli peletes de células com 25 ml de tampão de sonicação. Certifique-se de manter as garrafas de centrifugação em gelo em todos os momentos. </li><li> O sedimento ressuspenso étransferido para 50 ml de tubo Falcon de polipropileno e congelou-se utilizando azoto líquido. As células congeladas são armazenadas a -80 ° C para uso a longo prazo. </li><li> Antes de sonicação, descongelar as células congeladas, mantendo completamente os grânulos em gelo. As amostras descongeladas são transferidas para um copo de aço inoxidável estéril colocada em gelo durante sonicação. A sonda é submerso na amostra e sonicada durante 3 min. Um adicional de 2 minutos deixa-se arrefecer a amostra a partir de um sobreaquecimento. </li><li> O lisado celular sonicado é transferida para o tubo de centrifugação estéril pré-refrigerado, e submetido a centrifugação a 4 ° C em centrífuga Beckman utilizando um rotor JA-17 @ 35267 xg (16000 rpm) durante 15 minutos duas vezes. Nota: No caso da purificação de proteínas de membrana, o ligado celular é centrifugado sonicado apenas uma vez durante 15 minutos, porque não se sabe em que fracção são as proteínas da membrana, isto é, ou no sedimento ou na fracção sobrenadante. Assim, para evitar a perda excessiva de memproteínas branas, que gira as células durante 15 minutos a alta velocidade de centrifugação e o sobrenadante é subsequentemente processado para purificação (veja as etapas a seguir) em que 1% de detergente é usado para solubilizar as proteínas da membrana. </li><li> O sobrenadante do tubo de centrifugação é cuidadosamente transferido para um tubo de polipropileno de 50 ml Falcon e congelados usando azoto líquido. O extracto celular é armazenado congelado sonicado durante um período máximo de 6 meses à temperatura de -80 ° C para uso futuro. </li></ol> 3. A purificação por afinidade <ol><li> Antes de usar, 100 ul de anti-flag M2 pérolas são lavadas com 10 volumes de tampão de AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de detergente, e 0,1-0,5 mM TCEP [tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorídrico]), sem o detergente e o agente de redução de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). </li><li> A congelados, extrato celular sonicado é descongelado colocando o tubo em água fria. O extracto celular descongelado é incubado com 3 ul de benzonase nuclease durante 30 min a 4 ° C. A esta mistura, adicionar detergente não iónico Triton X-100 (concentração final do detergente deverá ser de 0,1%) e 200 ul de suspensões anti-FLAG M2 pérolas de agarose. Nota: Para todas as purificações de proteínas solúveis, 0,1% de Triton X-100 é utilizado para minimizar a adsorção não específica, enquanto que para a purificação de uma proteína de membrana, diferentes suaves detergentes não-iónicos, tais como o C12E8 (dodecil éter Octaethylene glicol), DDM ( n-dodecil β-D-maltósido) e maltose-neopentil-glicol (MNG) pode ser utilizado a uma concentração de 1% de detergente para melhorar a solubilização. Uma vez que os detergentes diferentes têm diferentes eficiência de solubilização de proteínas de membrana, é recomendável realizar a purificação de proteínas independentes, utilizando mais de um detergente. </li><li> O conteúdo é misturado suavemente por rotação do tubo durante 3 horas a 4 ° C, utilizando um agitador LabQuake. Depois de 3 horas de rotação, o tubo é centrifugado a 1700 xg durante 6 min. O sobrenadante é então removed cuidadosamente, tanto quanto possível, sem perturbar o sedimento solto grânulo. </li><li> O sedimento foi ressuspenso no sobrenadante remanescente e, em seguida, transferido para um 0,8 4 cm x Bio-Rad polipropileno coluna prep. Certifique-se de remover os tampões de saída do fundo da coluna, para permitir que os eluatos a escorrer por fluxo de gravidade. Lava-se a coluna 5 vezes com o passo de clivagem TEV. </li><li> Depois de drenar os eluatos lavados, da saída de fundo da coluna é fechada. À mesma coluna, a clivagem é realizada por adição de ~ 5-10 ul (50 unidades) de protease de TEV e 400 ul de tampão 1X AFC na coluna. Assegurar a fechar o topo da coluna com um tampão. A coluna que contém os grânulos são rodadas suavemente durante a noite a 4 ° C durante a noite utilizando um agitador de LabQuake. </li><li> Retire a tampa na parte superior e o tampão de saída na parte inferior da coluna, e drenar os eluatos recuperados após clivagem TEV em uma coluna de fresco contendo 200 ul de suspensões de calmodulina-sepharose grânulos, que é lavado por 10volumes de tampão de ligação a calmodulina. </li><li> A parte superior e na parte inferior da coluna estão bem apertados, e o conteúdo da coluna são misturados suavemente por rotação durante 3 horas a 4 ° C, utilizando um agitador LabQuake. </li><li> Depois de 3 horas de rotação, o eluato é drenada através da tampa superior e a tampa inferior da coluna. A coluna é lavada quatro vezes com 200 ul de 1X tampão de ligação a calmodulina, seguido por uma lavagem rigorosa com 400 ul de tampão de lavagem a calmodulina. </li><li> A proteína ligada foi eluída em quatro fracções de 50 uL em um novo tubo Eppendorf utilizando 1X tampão de eluição calmodulina. A fracção eluida é distribuído em dois tubos Eppendorf limpo em volumes iguais. Ambos os tubos são em seguida secos usando um vácuo de velocidade. </li><li> O eluato secas a partir de um tubo é usado para a execução de um gel de coloração de prata, enquanto o outro é armazenado a -80 ° C, antes de utilizar a espectrometria de massa. </li></ol> 4. A coloração de prata <ol><li> Para a prata staining, metade do volume de 3X SDS (dodecilsulfato de sódio) é adicionado tampão de amostra de 50 ul do eluído seco. Depois de ferver a mistura durante 5 min, as amostras são carregadas num gel de poliacrilamida SDS. </li><li> Após o gel ter terminado a execução, é cuidadosamente colocado em solução de fixação (metanol a 50% e 10% de ácido acético) e agitada suavemente num agitador rotativo durante 20 min. O gel é então lavado com etanol a 20% durante 10 min. </li><li> O gel é lavado duas vezes fixo cuidadosamente com 500 ml de água destilada duas vezes, durante 10 minutos para assegurar fundo uniforme baixa. </li><li> O gel é então agitada suavemente em 500 ml de tiossulfato de sódio para 1 min, seguida de duas etapas de lavagem com água destilada durante 20 segundos. </li><li> A água é eliminada, e o gel é incubado em 200 ml de nitrato de prata a 0,1% durante 30 min. Após esse tempo, o nitrato de prata é removida e o gel foi lavado com água destilada durante 20 segundos para remover o excesso de nitrato de prata. </li><li> O gel é finalmente agitada à mão em 75 mlda solução de revelação. Quando a intensidade desejada é alcançada, a solução reveladora é descartado e 80 ml de ácido acético é adicionado para parar a reacção. Assegure-se incubar o gel em ácido acético durante um período mínimo de 20 min para a visualização adequada das bandas do gel. </li></ol> 5. Proteólise e Preparação de Amostras para Espectrometria de Massa <ol><li> Para a amostra seca, adicionar 50 ul de tampão de digestão do e 0,9 ul de 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorídrico) e incubar a mistura durante 45 min à temperatura ambiente para a fase de redução. Em seguida, 1 ml de 500 mM de iodoacetamida ea placa é incubada no escuro durante 40 min outro para permitir a alquilação de amostra. </li><li> Depois da segunda ronda de incubação, adicionar 1 mg de tripsina imobilizada à mistura e incubar quer a 37 ° C durante 5 horas ou durante a noite à temperatura ambiente. Assegurar a parar a reacção por adição de 1 ul de ácido acético. </li><li> Pré-molhado Millipo ore Zip Tip-ponta da pipeta de aspiração por 10 ul da solução de equilíbrio e de molhagem. Dispensar a solução para o lixo. Subsequentemente aspirar 10 ul de solução de lavagem e dispensar a solução para o lixo. Repetir este passo duas vezes. </li><li> Para a ligação eficiente da mistura de péptidos para a ponta, pipeta misturar a mistura de péptidos de 20 vezes. A mistura de péptidos que adere à ponta é lavado, aspirando e dispensando a solução de lavagem. Repetir este procedimento duas vezes para a ligação eficiente da mistura de péptidos para a ponta. </li><li> Com a ponta contendo o péptido ligado, aspirar 10 ul da solução de equilíbrio e de molhagem, e dispensar para um tubo eppendorf limpo. Repetir este passo duas vezes. Após a secagem das amostras eluídas em vácuo de velocidade, as amostras podem ser analisadas por espectrometria de massa imediatamente ou armazenados a -80 ° C antes da utilização. </li></ol> 6. Identificação de proteínas por LTQ Orbitrap Velos Espectrômetro de Massa Thcomponentes electrónicos polipeptídicas dos complexos isolados são identificadas usando um Orbitrap LTQ Velos híbrido espectrómetro de massa em tandem. O Orbitrap tem poder de resolução excepcional (&gt; 60.000 Máxima Meia Largura Total a, ou FWHM) e precisão de massa (&lt;2 ppm), que minimiza a MS / MS de amostragem irrelevantes contaminantes não-específicos de fundo detectada em purificações de controlo, enquanto que a elevada velocidade Velos ion trap componente pode detectar e péptidos fragmento baixa abundância utilizando tanto a transferência de electrões e os modos de dissociação induzida por colisão de dissociação. Partidas de confiança elevados entre MS resultante / MS espectros são mapeados para referência E. seqüências de proteína coli usando o algoritmo de pesquisa de banco de dados como Sequest e cada seqüência de correspondência avaliados durante um algoritmo de probabilidade como STATQUEST 11. O número de espectros total, singularidade sequência peptídica e contaminantes detectados no fundo comuns de controlo negativo (isto é. Mock) são considerados purificações para alcançar um baixo empírica falso-distaxa de redescoberta. Os passos seguintes são realizados para identificação de proteínas: <ol><li> As micro-colunas são embalados com ~ 10 cm de 3 m Luna C-18 e da resina são interligados com uma fonte de iões Proxeon nanoelectrospray que é colocado em linha com o instrumento Orbitrap. </li><li> Um fluxo Proxeon nano binário bomba HPLC é usada para fornecer uma taxa de fluxo estável ponta de ~ 300 nl min -1 durante as separações peptídicas. </li><li> Para alcançar eluição peptídeo, um gradiente de tampão orgânico é criado de acordo com a complexidade da amostra. Por exemplo, o gradiente que se segue é tipicamente configurado para E. Amostras de E. coli SPA: solvente B é aumentada de 2% a 6% em 1 min, a 24% em 38 min, a 100% em 4 min em seguida, mantida a 100% durante 1 min, em seguida, reduzida para 2% em 1 min, e final mantenha a 2% durante 15 min. A fase móvel tem um solvente de 95% por HPLC de gradiente de água e 5% de ACN com 0,1% de ácido fórmico, enquanto B tem 5% de solvente HPLC gradiente de água e 95% de ACN com 0,1% de ácido fórmico acid. A taxa de fluxo a ponta da agulha está definido para 300 nl min -1 durante 60 min. </li><li> Como os ciclos de espectrômetro de massa executado através de uma varredura completa em massa 60.000 resoluções, 10 concomitantes em tandem varreduras em massa de fragmentação são coletados para os íons precursores mais intensos. Exclusão dinâmica, seleção massal monoisotópico, e em tempo real de dados dependentes de características do instrumento de aquisição estão habilitados. </li><li> Os espectros são pesquisados ​​utilizando um algoritmo de busca de banco de dados, tais como Sequest contra um banco de dados de E. sequências de proteínas de E. coli, e o resultado é estatisticamente filtrada utilizando um algoritmo de probabilidade, como STAQUEST 11 para assegurar uma taxa de detecção baixa falso. Apenas os candidatos de confiança elevada (99% de probabilidade) são seleccionados, enquanto os jogos mostrando mais do que 10 ppm de massa de erro em comparação com a massa teórica de péptidos são eliminadas de consideração posterior. </li></ol>

<ol>
	<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li><li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins.">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).</li><li>Krogan, N. 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Biol. 4, 174 (2008).</li><li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli.">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um aspecto chave da abordagem baseada em STDA SPA descrito aqui, é que a marcação é feita dentro do contexto natural cromossómica, assegurando desse modo a regulação do gene normal é mantida (isto é. Isca promotor nativo conservado, portanto os níveis de expressão não é perturbada) e estavelmente nativo associado complexos de proteínas são recuperadas em quase endógenos níveis. Problemas de polaridade operão também são evitados mediante a inclusão de um promotor de orientada para o exterior...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>and Catalog Numbers</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>I. Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#KAN201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMP201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Terrific-Broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Tryptone</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRP 402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#YEX 555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#GLY 002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. Bacterial Strain and Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DY330</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Yu et al. (2000)10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJL148</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Zeghouf et al. (2004)7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. PCR and Electrophoresis Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PCR buffer</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mM MgCl2</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AGA002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#B7021S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># ETB444</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#28355</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRS001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#BOR001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># E6768</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#N3232L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. Plasmid isolation and Clean-up Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Midi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#28104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. PCR and Transformation Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iCycler</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>GenePulser II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 cm electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>42 &deg;C water bath shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Innova 3100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TS-5.1-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C large Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C plate incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>7. Electrophoresis and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AMP001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># B7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TEM001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#09-806A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean 3 cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#165-3301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot gel transfer device</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#IB1001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#162-0115</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F3165</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>#NA931V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained protein molecular weight standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0363</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence reagent</td>
			<td>PIERCE</td>
			<td>#1856136</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Clonex Corp</td>
			<td>#CLEC810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Draw blotting paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7796</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2 platform rocking shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>8. Sonication Equipment and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonic</td>
			<td>#23395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOD001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#800-363-5887</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mM TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#20490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>9. Affinity Purification Reagents and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#732-6008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>#70746</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG M2 agarose beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A2220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin-sepharose beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#17-0529-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#12575-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2661</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabQuake Shaker</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>#59558</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>10. Silver Staining Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#MET302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>t#ACE222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-thiosulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-7143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#S181-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#FOR201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOC512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>11. Reagents and Equipment for Protein Identification </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td># V5280</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM NH4HCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMC555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#CCL302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A998-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#95304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#16125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Zip-Tip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td># ZTC18M960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~10 cm of 3 &mu;m Luna-C18 resin</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxeon nano HPLC pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>12. Labware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 liter conical flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#89000-372</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene falcon tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml conical flaks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#29140-045</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile culture tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#366052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#479-3221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &deg;C freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#13-990-14</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Buffers and Solutions
			1. 1 liter Terrific Broth (TB) media
			11 g Bio-Tryptone 
			22 g Yeast Extract 
			2% Glycerol 
			50 ml potassium salt stock solution
			2. Potassium Salt Stock Solution
			1.5 M K2HPO4 
			0.35 M KH2PO4
			3. Sonication Buffer
			20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			10% Glycerol 
			Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP
			4. AFC buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			5. TEV cleavage buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			6. Calmodulin binding buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			7. Calmodulin wash buffer
			30 mM Tris-HCl pH 7.9 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1-0.5 mM TCEP
			8. Calmodulin elution buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			100 mM NaCl 
			10 mM EGTA 
			0.1-0.5 mM TCEP
			9. Developing solution (1L)
			37% Formaldehyde 
			30 g sodium carbonate 
			1000 ml distilled water
			10. Digestion buffer
			50 mM NH4HCO3 
			1 mM CaCl2
			11. Wetting and Equilibration solution
			70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid
			12. Washing solution
			100% H2O in 0.1% formic acid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein complexes in escherichia coli using sequential peptide affinity purification in combination with tandem mass spectrometry

Uma vez que a maioria dos processos celulares são mediadas por montagens macromoleculares, a identificação sistemática de interacções proteína-proteína (PPI) e à identificação da composição de subunidades de vários complexos de proteína pode fornecer informações sobre a função do gene e aumentar a compreensão dos sistemas biológicos 1 e 2. Interacções físicas podem ser mapeados com alta confiança isolamento vialarge escala e caracterização de complexos de proteínas endógenas sob condições fisiológicas quase baseados em purificação de afinidade de proteínas cromossomicamente etiquetados em combinação com espectrometria de massa (STDA). Esta abordagem tem sido aplicada com sucesso em organismos evolutivamente diversas, incluindo levedura, moscas, vermes, células de mamíferos e bactérias 1-6. Em particular, têm gerado um carboxi-terminal Affinity Peptide seqüencial (SPA) sistema de marcação dupla para afinidade com purificação de complexos de proteínas nativas cultivadas coli gram-negativas coli, usando genetically-tratáveis ​​hospedeiras estirpes laboratoriais que estão bem adaptados para as investigações do genoma da biologia fundamental e processos conservadas de procariotas 1, 2, 7. O nosso sistema de SPA-marcação é análogo ao método de purificação por afinidade em tandem desenvolvido originalmente para levedura 8, 9, e é composto por uma ligação peptídica a calmodulina (CBP), seguido do local de clivagem para a protease altamente específico do tabaco vírus etch (TEV) e três cópias do epitopo FLAG (FLAG 3X), permitindo dois ciclos consecutivos de enriquecimento por afinidade. Após a amplificação da cassete, a sequência específica de produtos lineares de PCR que codificam o SPA-tag e um marcador de selecção são integradas e expressas em quadro como carboxi-terminais fusões em um fundo DY330 que é induzida a expressar transitoriamente um altamente eficiente sistema de recombinação heteróloga bacteriófago lambda 10. Purificação de dupla etapa subsequente utilizando calmodulina e grânulos anti-FLAG de afinidade permite a altamente selectivoe recuperação eficiente de até complexos de baixa abundância de proteínas de grande escala culturas. Espectrometria de massa é, então, usado para identificar as estavelmente co purificação de proteínas com uma sensibilidade elevada (limites de detecção baixos de nanogramas). Aqui, descrevemos detalhadas passo-a-passo os procedimentos que comumente utilizam para purificação de proteínas sistemática de marcação, e espectrometria de massa com base em análise de complexos de proteínas solúveis de E. coli, que podem ser expandidos e potencialmente adaptada para outras espécies bacterianas, incluindo certos agentes patogénicos oportunistas que são passíveis de recombineering. As interações físicas resultantes muitas vezes pode revelar interessantes componentes inesperados e conexões sugerindo novas ligações mecanicistas. Integração dos dados do PPI com alternativas de associação de dados moleculares, como genéticos (gene-gene) interações e genômica de contexto (GC) previsões podem facilitar a elucidação da organização global molecular de proteínas multi-complexos dentro bicaminhos fisiológicos. As redes geradas por E. coli pode ser usado para obter insights sobre a arquitetura funcional de produtos de genes ortólogos em outros micróbios para que anotações funcionais actualmente não existem.

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.co

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a bactéria<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Que pode ser usado para isolar e caracterizar estáveis ​​múltiplos complexos proteína-à homogeneidade a partir de perto mesmo números de cópias baixos por célula.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

identification-protein-complexes-escherichia-coli-using-sequential

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

48.2K visualizações.  University of Toronto. A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a bactéria Escherichia coli Que pode ser usado para isolar e caracterizar estáveis ?...

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...