A pesquisa do vírus da hepatite E tem sido dificultada pela falta de um sistema eficiente de cultura celular. Nossas técnicas superam essas limitações abrindo caminho para o design de medicamentos e o desenvolvimento de vacinas. Com este protocolo, somos capazes de produzir vírus infecciosos de alta titulação de partículas hev não-envelope e envelope, facilitando a infecção de uma variedade de células.
A execução deste protocolo requer acesso a uma instalação BSA-2 e experiência com técnicas básicas de cultura celular. Para linearizar o DNA plasmídeo, misture 10 microgramas do DNA modelo com 10 microliters de tampão e dois microliters da enzima de restrição de micrococcus luteus e ajuste o volume final para 100 microliters com água. Em seguida, incubar a solução por uma hora a 37 graus Celsius e confirmar a linearização do plasmídeo por eletroforese de gel agarose de acordo com os protocolos padrão.
Após o isolamento e a linearização do DNA plasmídeos, o sucesso da linearização pode ser verificado comparando o DNA plasmídeo não digerido ao DNA plasmídeo digerido por eletroforese gel. Para transcrição in vitro do DNA purificado do vírus da hepatite E, misture dois microgramas do modelo de DNA linearizado com os reagentes apropriados e use água sem núcleo para levar o volume final da solução a 100 microliters. Após uma mistura minuciosa, incubar a solução por duas horas a 37 graus Celsius.
Após duas horas, adicione mais dois microliters de polimerase T7 RNA ao tubo. Em seguida, misture a reação e incubar o tubo a 37 graus Celsius por mais duas horas. Ao final da incubação, digerir o modelo inicial de DNA com 7,5 microliters de DNAs com mistura completa e incubar por 37 graus Celsius por 30 minutos.
Após a extração, verifique cuidadosamente a integridade do RNA e o rendimento por eletroforese de gel agarose de acordo com os protocolos padrão. No caso de baixa abundancy RNAs, bandas distintas, em vez de uma mancha borrada devem ser observadas. Algumas etapas requerem execução rápida e, portanto, preparação minuciosa.
Além disso, preste atenção especial à integridade do RNA e à viabilidade celular. Para preparar células cancerígenas do fígado humano para a produção de vírus de hepatite E derivadas da cultura celular, semeou as células em 20 mililitros de DMEM completos em um prato de cultura revestido de colágeno de 15 centímetros e incubar a 37 graus Celsius até atingirem 90% de confluência. No final da cultura, lave as células com 10 mililitros de PBS antes de descolá-las da placa de cultura celular com três mililitros de 0,05% Trypsin-EDTA a 37 graus Celsius.
Resuspend as células separadas em 10 mililitros de DMEM completos e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para contagem. Transfira cinco vezes 10 para as seis células para um novo tubo de 50 mililitros e lave as células duas vezes com 35 mililitros de PBS por lavagem. Após a segunda lavagem, coloque as células no gelo sem remover o supernatante.
Para eletroporação das células-alvo, suplementar 384 microliters de citomix com dois ATP mililitros e cinco glutationa milimor, posteriormente armazenar no gelo até uso adicional. Substitua cuidadosamente o supernascer por todos os 400 microliters de solução. Adicione cinco microgramas de RNA genômico viral purificado às células e transfira a suspensão celular para um cuvette de quatro milímetros para eletroporação a 975 microfarad e 270 volts por 20 milissegundos.
Após a eletroporação, use uma pipeta Pasteur para transferir as células o mais rápido possível em 11 mililitros de DMEM completos e sementes 10 mililitros das células eletroporadas em um prato de cultura de 10 centímetros revestido com colágeno. Em seguida, adicione 1,3 vezes 10 às quintas células em 300 microliters de médio uniformemente em um deslizamento de cobertura em um poço de uma placa de 24 microtiter revestida de colágeno e coloque o prato e o prato na incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, substitua o supernascedor no prato por 10 mililitros de DMEM fresco e devolva o prato à incubadora de cultura celular por mais seis dias.
No quinto ao sétimo dia, dependendo da densidade celular, realizar a coloração imunofluorescente do controle de transfecção para permitir o cálculo do número de células expressando a proteína alvo de interesse normalizada ao número total de células. A eletroporação bem sucedida pode ser monitorada pela coloração imunofluorescente do controle de transfecção. A eficiência da transfecção deve exceder 40% Um mutante deficiente de replicação pode servir como um controle negativo para confirmar a especificidade da coloração.
Para colher partículas extracelulares derivadas da hepatite E, no sexto dia, filtrar o supernascer através de uma malha de 0,45 microliter para remover quaisquer detritos celulares e armazenar o vírus da hepatite E derivado da cultura extracelular a quatro graus Celsius. Para a colheita de partículas de partículas do vírus da hepatite E derivada da cultura intracelular, lave as células com PBS e despreze as células com 1,5 mililitros de 0,05% Trypsin-EDTA a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, pare a reação com 8,5 mililitros de DMEM e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros para centrifugação.
Adicione 1,6 mililitros de DMEM meio completo por eletroporação a dois tubos de reação de mililitros individuais e use 800 microliters do meio para resuspencar as células, transferindo assim as células para os tubos. Congele as células em nitrogênio líquido e, posteriormente, descongele as células no gelo três vezes antes de centrifugar os lises resultantes por 10 minutos a 10.000 vezes g. Em seguida, transfira os supernantes para novos tubos sem perturbar as pelotas de detritos celulares por menos 80 graus Celsius de armazenamento.
Para avaliar os títulos dos recém-produzidos estoques de vírus de hepatite E intra e extracelular, semente duas vezes 10 para as quatro células por 100 microliters de MEM por poço nos 60 poços centrais de uma placa microtiter revestida de colágeno e encher os poços mais externos com 100 microliters de PBS por poço. Após 24 horas a 37 graus Celsius, adicione 50 microliters de supernatante de partículas de vírus extracelular à primeira fileira de células. Após a mistura completa, dilui o conteúdo do poço seis vezes em uma concentração de um a três por poço, transferindo 50 microliters de supernascer do anterior para a próxima linha de células em duplicação até a última linha de células.
Para infectar as células com partículas de vírus de hepatite E derivadas da cultura intracelular, adicione 25 microliters do supernatante de partículas do vírus intracelular à linha superior das células e misture bem antes de diluir as células seis vezes em uma proporção de um a cinco com 25 microliters de diluição em duplicata como demonstrado. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por sete dias antes da coloração imunofluorescente de acordo com o protocolo no manuscrito. Após a incubação e a coloração imunológica, as placas podem ser analisadas usando microscopia de imunofluorescência.
Após a imunossuagem do título final das partículas intra e extracelulares pode ser calculado usando a fórmula apropriada como indicado. Após a infecção celular alvo com partículas de vírus E derivadas da cultura celular por diluição serial, titulações entre uma vez 10 a 10 e três vezes 10 para as seis unidades de formação de foco por mililitro podem ser esperadas das culturas celulares infectadas com as partículas de vírus de hepatite E derivadas da cultura celular não envolta. Em culturas infectadas com partículas de vírus de hepatite E derivadas da cultura extracelular, são esperadas titulações entre uma vez 10 a 10 vezes 10 para o quarto foco formando unidades por mililitro.
Além disso, a razão entre cópias do genoma e partículas de vírus infecciosos intracelulares não envoltas é tipicamente menor do que a observada para cultura extracelular derivada da cultura de hepatite E culturas infectadas pelo vírus da hepatite E, sugerindo uma maior infectividade específica das espécies não-envoltas do vírus da hepatite E. A produção de partículas virais e a infecção celular alvo requerem um ciclo de vida viral completo, e podem fornecer novas percepções sobre as interações entre vírus e hospedeiros. Este protocolo pode ser modificado para realizar cinética de replicação ou para produzir partículas que podem ser usadas em ensaios de infecção.
A maioria de nossa pesquisa atualmente depende de partículas infecciosas, tanto no HEV envolto e não envolto. E artigos usando nossas técnicas estão sendo publicados.
