Agradecemos as importantes contribuições dos drs. John Anderson, Andrew principal e Shirley Tirrell a este estudo. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e do Departamento de Agricultura dos EUA (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).

1. Triagem e identificação de mosquitos <ol><li> Os seguintes procedimentos são realizados em uma bancada de laboratório aberto em uma dedicada biossegurança de nível 2 (BSL-2) por pessoal de laboratório que são treinados para trabalhar com os mosquitos vivos. A &quot;cadeia de frio&quot; é mantida durante todo o procedimento. </li><li> Anestesiar os mosquitos adultos vivem colocando bolsa coletora de mosquito em um freezer -20 ° por 5 minutos. Saco de transferência de coleção para um recipiente isolado contendo gelo seco. Feche a tampa e expor mosquitos para dióxido de carbono durante 1-3 minutos para garantir a completa knock-down. </li><li> Toque mosquitos anestesiados em uma panela pré-refrigerados colocado sobre uma cama de gelo seco. Individual separada mosquitos fêmeas usando uma pinça fina e coloque em copos de plástico. Cubra com tampa e coloque em copos de gelo molhado. </li><li> Identificar as espécies de mosquitos utilizando chaves taxonômicas descritiva com base na morfologia externa mosquito com o auxílio de um microscópio estéreo de dissecação (10-60X zoom) montado em uma mesa de frio eletrônica. </li><li> Combine identificou espécies de mosquito em piscinas de ≤ 50 indivíduos em 2 mL pressão cap-frascos contendo um BB de cobre. Frascos estão identificados com um identificador exclusivo. </li><li> Após a identificação de todos os mosquitos, os frascos são colocados em sacos etiquetados e mantidos em um refrigerador de isopor contendo gelo seco. </li><li> Loja pools de mosquitos em um freezer -80 ° C até que o teste do vírus. </li></ol> 2. Considerações de biossegurança para isolar vírus a partir de mosquitos <ol><li> Os seguintes procedimentos são realizados em um nível de biossegurança 3 (NB-3) de laboratório por funcionários que são treinados para trabalhar com este nível de contenção de 1. Laboratórios, equipamentos, procedimentos e práticas estão sujeitos à fiscalização institucional, estaduais e federais e de inspeção. Buscar a formação adequada e aprovação antes de tentar os seguintes protocolos. </li><li> Usar o equipamento de proteção individual (EPI) para cada procedimento, como batas descartáveis, luvas, protetores faciais, e respiradores. </li><li> Desinfetar superfícies de trabalho com álcool 70% antes e após os procedimentos de completar. </li><li> Culturas de células e materiais potencialmente infecciosos são tratados de Classe II biossegurança gabinete (BSC). </li><li> Pools de mosquitos são homogeneizadas em um misturador-mill que é colocado dentro de um BSC. </li><li> Homogeneizados de mosquito são centrifugadas em uma microcentrífuga anti-aerossol. Se este procedimento não pode ser realizada dentro de um BSC, o operador deve usar um respirador durante a operação e recuperação de amostras da centrífuga. </li><li> Pipetas e pontas de pipeta de manuseio de materiais no BSC (biossegurança gabinete) são embebidos em água sanitária a 10% antes da autoclavagem. Todos os resíduos de laboratório é descontaminados em autoclave antes do descarte. </li></ol> 3. Preparação de células Vero <ol><li> Decantar meios de cultura de um grande frasco de cultura de tecidos (175 cm 2) de células Vero confluentes (Clone E6) em copo resíduos contendo lixívia. </li><li> Lave as células Vero, adicionando uma alíquota de 5 mL de PBS e agite sobre a camada de células e ao longo dos lados do frasco certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro. </li><li> Decantar PBS em copo de resíduos. </li><li> Adicionar 2,5 mL de tripsina-EDTA e agite sobre camada de células certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro. </li><li> Incubar balão em incubadora por 5 minutos a 37 ° C CO, 5% 2. </li><li> Agitar suavemente e frasco agite para remover as células da superfície inferior. As células devem deslizar facilmente; incubar um adicional de 1-5 minutos se as células não são facilmente escorregar. </li><li> Adicionar 5 mL de Minimal Essential Media (MEM), 5% de soro fetal bovino (FBS), usando uma pipeta sorológica e pipeta up-and-down 10-20 vezes para quebrar os aglomerados de células. </li><li> Adicionar um adicional de 15 mL de MEM, 5% FBS para um volume total de 22,5 mL e misture bem. </li><li> Coloque 40 frascos pequenos cultura de tecidos (25 cm 2) na vertical em dois racks (20 frascos / rack). </li><li> Coloque o racks contendo frascos dentro da cabine de segurança biológica e remover capacetes frasco, colocando tampas em frente dos frascos. </li><li> Dispense 4 mL de MEM, FBS 5% em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica. </li><li> Dispense 0,5 mL células em suspensão em cada frasco (~ rácio divisão 1:6) Substitua as tampas frasco. </li><li> Adicionar 50 mL de MEM, 5% FBS de volta para o balão de grande cultura de tecidos de origem, contendo suspensão de células restantes (~ 2,5 ml) e retornar balão até a incubadora. O frasco mesma cultura grande tecido pode ser reutilizado até 5 passagens e, em seguida, um frasco deve ser novo set-up para substituí-lo. </li><li> Coloque pequenos frascos de cultura de tecidos em pilhas de bandeja. Redemoinho da bandeja para se certificar de que a mídia de maneira uniforme cobre o fundo do charlatões. </li><li> Coloque pequenos frascos na incubadora a 37 ° C CO, 5% 2 e crescer durante a noite até confluentes 80-90%. </li></ol> 4. Preparação dos pools de mosquitos <ol><li> Manter pools de mosquitos frio durante os procedimentos de teste. Use pré-refrigeradosracks freezer e liquidificador moinho de cassetes, gelada reagentes e uma centrífuga refrigerada durante o processamento de pools de mosquitos. </li><li> Colocar os tubos contendo os mosquitos em um rack freezer pré-refrigerados e adicionar 1-1,5 mL PBS-G para cada tubo de mosquitos. </li><li> Recuperar misturador moinho de cassetes do freezer. Coloque 24 tubos em cada cassete e depois segura no misturador-mill. </li><li> Homogeneizar as amostras durante 4 minutos a 25 ciclos / segundo. O moinho misturador sacode os tubos em alta velocidade e um BB de metal dentro de cada tubo rompe o tecido do mosquito. </li><li> Centrifugar os tubos por 6 minutos a 7.000 rpm. </li><li> Colocar os tubos de volta para racks freezer até inoculados em células Vero. </li></ol> 5. Inoculação de células Vero com homogenatos piscina mosquito <ol><li> Verifique pelo menos um frasco de cultura de tecido de cada série em microscópio invertido para assegurar a saúde e confluência celular adequada; esperar cerca de 80-90% de cobertura. </li><li> Line up 20 frascos pequenos cultura de tecidos em um rack e frascos de etiquetas com números de adesão correspondente de cada grupo mosquito. </li><li> Solte as tampas e mais decantar dos meios de comunicação de frascos de cultura de tecidos em copo de resíduos. Deixe a mídia o suficiente no frasco completamente monocamada de células do revestimento. </li><li> 100μL alíquota do sobrenadante de cada grupo mosquito processados ​​para o balão correspondente cultura de tecidos. </li><li> Recolocar e apertar cap garrafa de cultura. </li><li> Lay frascos de cultura de apartamento no shaker por 5 minutos (temperatura ambiente) a 35-40 rpm. </li><li> Retorno de 20 frascos de cultura de tecidos para a posição vertical em um rack e coloque no BSC. </li><li> Desoperculação 3 frascos de cultura de tecido de uma só vez, dispensar quatro meios de crescimento mL em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica, recoloque as tampas. </li><li> Certifique-se que a ponta da pipeta não contato com o gargalo do balão cultura ou lábio. Trocar a ponteira, se necessário, se o contato é feito com o frasco. </li><li> Frascos de cultura de tecidos incubar a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 6. Triagem células Vero para o crescimento do vírus <ol><li> Tela inoculados frascos de cultura de tecidos para sinais de infecção viral, o efeito citopático (CPE), 3-7 dias após a inoculação. </li><li> Inspecionar visualmente culturas de células para CPE e / ou contaminação pela inclinação do frascos e examinar os meios de comunicação que reúne na parte inferior do balão. A mídia vai aparecer nublado como as células se deterioram durante o CPE ou devido ao crescimento de leveduras, fungos ou contaminação bacteriana. </li><li> Re-examinar culturas de células que exibem media nublado em microscópio invertido. Vírus fará com que as células se tornam deformadas e libertar-se dos frascos de cultura. Culturas de células com contaminantes visíveis, por exemplo, o fermento, outras bactérias, fungos ou detritos mosquito pesados, são re-testadas, passando a piscina mosquito original através de um filtro de seringa 0.22μM. </li><li> Assepticamente dispensar 1-2 mL de mídia a partir do vírus-positivos culturas de células em criotubos rotulados com uma pipeta sorológica. </li><li> Culturas de vírus são armazenadas a -80 ° C até identificados utilizando os ensaios de diagnóstico apropriado. </li></ol> 7. Preparação de reagentes <ol><li> MEM, 5% FBS. Dissolver 37,6 g de MEM em pó em um volume final de 4 L de dd H 2 0. Dispense solução em 500 mL em frascos de alíquotas de mídia e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 26 inativado pelo calor mL de soro fetal bovino, 5,2 mL L-glutamina, 5,2 anti-biotic/mycotic mL, e 10,4 mL de bicarbonato de sódio 7,5% para cada garrafa. Armazenar a 4 ° C. </li><li> PBS-G. Dissolver 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4, e 4 mL de 0,5% Vermelho Fenol em 1000 mL dd H 2 0. Ajustar o pH a 7,1-7,4 com 2 N NaOH (se necessário). Num copo separado, o calor de 600 mL H 2 0 a ferver. Remover da placa-quente, adicione 10 g de gelatina, e dissolver. Adicione a gelatina dissolvida solução para a solução PBS e ajustar o volume final de 2 L com dd H 2 O. Dispensar 100 mL de solução em garrafas e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 42,8 ml de soro de coelho inativado pelo calor e 1,4 anti-biotic/mycotic mL. Armazenar a 4 ° C. </li><li> PBS lavar celular. Adicionar 50 mL 10X Dulbecco PBS a 400 mL dd H 2 O. Ajustar o pH para 7,1 com NaOH 2 N. Ajustar o volume final de 500 mL com dd H 2 O. Solução de filtro com unidade de vácuo 0.2uM filtro. Dispense em 5 mL em alíquotas de 8 mL tampa de rosca tubos. Armazenar a 4 ° C. </li></ol> 8. Resultados representante Nove diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas foram recuperados a partir de mosquitos coletados durante a vigilância contínua em todo o estado de Connecticut 1997-2010 (tabela 1). Cinco desses vírus são conhecidos por causar doenças no homem, os patógenos mais importantes que estão sendo vírus do Nilo Ocidental e Oriental, vírus da encefalite eqüina. Novas descobertas incluem: o primeiro isolamento do WNV a partir de mosquitos coletados emAmérica do Norte em 1999 2, o primeiro isolamento do vírus Potosi, no nordeste dos EUA em 2000 3, eo ​​primeiro isolamento do vírus La Crosse na Nova Inglaterra em 2005 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Vírus </td><td> Família </td><td> Não. isola </td><td> Locais No. </td><td> Não. ano detectado </td><td> Doença humana </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Vírus do Nilo Ocidental </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Moderada a grave, febre, encefalite </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Oriental vírus da encefalite eqüina </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Encefalite, grave </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J vírus </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Não conhecido </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Canyon vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Leve a moderada, febre, meningite </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Vírus Potosi </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Não conhecido </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Leve a grave, febre, doença neurológica em dois casos documentados </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Não conhecido </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Moderada a encefalite, grave </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flanders vírus </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Não conhecido </td><td></td></tr></tbody></table> Vírus tabela 1. Detectado no campo de coleta de mosquitos por Vero ensaio de cultura de células. Os mosquitos foram coletados durante a vigilância em todo o estado de Connecticut 1997-2010.

<ol>
	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vero ensaio de cultura celular serve como um método eficaz para mosquitos tela de campo recolhidas para uma diversidade de vírus. Isto contrasta com os métodos moleculares que atingem especificamente a um ou alguns vírus de interesse. Além disso, descobrimos que ensaio de cultura de células Vero é tão ou mais sensível do que a RT-PCR 7 e fornece-nos isolados do vírus que são armazenados em nossa coleção de referência para estudos futuros. No entanto, os sistemas de cultura de células pode não ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> De bicarbonato de sódio NaHCO 3, Soln 7,5%. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200mM 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Meio mínimo essencial em pó (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Soro de coelho </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Células Vero (Clone E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Frascos de cultura de tecido pequena, tampas ventiladas, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Frascos grandes de tecido de cultura, tampões ventilados, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Cobre revestido do BB, 4,5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mixer Moinho </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Freezer racks Isopack </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

Os mosquitos transmitem uma série de vírus diferentes, incluindo importantes patógenos humanos, tais como vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue eo vírus chickungunya. Muitos desses vírus se intensificaram nas suas gamas endêmicas e se expandiu para novos territórios, necessitando de programas eficazes de vigilância e controle para responder a essas ameaças. Uma estratégia para monitorar a atividade do vírus envolve a coleta de um grande número de mosquitos dos locais endêmicos e testá-las para a infecção viral. Neste artigo, descrevemos como lidar, processo e tela de campo coletados mosquitos de vírus infecciosos de células Vero por ensaio de cultura. Os mosquitos são classificadas por localização armadilha e espécies, e agrupados em pools contendo ≤ 50 indivíduos. Espécimes agrupados são homogeneizados em salina tamponada com um misturador-mill ea fase aquosa é inoculada em culturas de células Vero confluentes (Clone E6). Culturas de células são monitorados para efeito citopático do dia 07/03 pós-inoculação e qualquer vírus cresceu em cultura de células são identificadas pelos testes de diagnóstico apropriado. Ao utilizar esta abordagem, temos isolados 9 tipos diferentes de vírus a partir de mosquitos coletados em Connecticut, EUA, e entre estes, cinco são conhecidos por causar doenças no homem. Três destes vírus (vírus do Nilo Ocidental, vírus Potosi e La Crosse vírus) representam novos registros para a América do Norte ou da região da Nova Inglaterra desde 1999. A capacidade de detectar uma grande diversidade de vírus é fundamental para monitoramento ambos estabelecidos e vírus emergentes na população de mosquitos.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K visualizações.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

De células vivas de Alphaherpes Vírus Transporte anterógrada e Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Imunologia e Infecção

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Um modelo de cultura primária de células bolsas serosas Ex Vivo frango para estudar a patogênese de doenças infecciosas bolsas serosas vírus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Identificação de Mouse e repertórios de anticorpo humano por sequenciamento de próxima geração

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...