Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da virologia aviária, como como os vírus imunossupressores interagem com as células B. A principal vantagem dessa técnica é que as células são mais relevantes do que as linhas celulares imortalizadas atualmente utilizadas no laboratório. Embora este método forneça uma visão de como as células de frango respondem ao IBDV, ele também pode ser aplicado à ALV e AO REV.
Este método reduz o número de aves em nossa pesquisa, e é benéfico para os três Rs, que significa a substituição, redução e refinamento do uso de animais em pesquisa. Em um armário de segurança microbiológico, lave a BF em 30 mililitros de PBS frio pelo menos três vezes. Transfira o tecido lavado para uma placa de Petri, e adicione cinco mililitros de uma solução de colagenase D 1X.
Use uma tesoura estéril ou uma lâmina de bisturi para cortar a BF em pedaços com menos de cinco milímetros de diâmetro. Incubar a 37 graus Celsius com agitação suave periódica por 30 minutos. Depois disso, use uma pipeta Pasteur estéril para aspirar repetidamente a mistura para incentivar a desintegração do tecido.
Adicione mais cinco mililitros de solução de colagenase D 1X ao tecido, e incuba-o a 37 graus Celsius com agitação suave periódica por mais 30 minutos. Repita esse processo, aspirando a mistura, adicionando nova solução de colagemnase D e incubando até que o tecido seja completamente digerido. Note que haverá pequenos grânulos que não se dissolverão mais.
Passe a suspensão celular digerida através de um coador de células de 100 mícrons em 20 mililitros de 1X HBBS sem cálcio. Centrifugar a 400 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernascimento, resuspenque a pelota em 10 mililitros de 1X RPMI com 5%FBS.
Em seguida, sobreponha 10 mililitros da suspensão celular em cima de cinco mililitros de mídia gradiente de densidade que contém polisucrose e diatrizoato de sódio. Certifique-se de que há uma interface clara entre as duas camadas. Centrifugar a 900 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos.
As células devem formar uma banda na interface entre a mídia celular e a mídia gradiente de densidade. Em seguida, use uma pipeta Pasteur estéril para remover as células e transferi-las para um tubo contendo PBS frio. Lave as células centrifugando-as a 400 vezes g por cinco minutos e, em seguida, resumá-las em PBS frio.
Repita esta lavagem três vezes. Primeiro, centrifugar a suspensão da célula a 400 vezes g por cinco minutos. Resuspense as células em 30 mililitros de 1X iMDM completo.
Pegue uma alíquota da suspensão da célula e adicione-a a uma solução azul Trypan. Conte o número de células viáveis que excluem o azul Trypan, e determine o número de células e a viabilidade percentual. Depois disso, centrifufique a suspensão da célula a 400 vezes g por cinco minutos.
Resuspend as células em IMDM completo suplementado com uma diluição de 1-20 de ligante CD40 de frango a uma densidade de 10 milhões de células por mililitro. Cultue as células em placas de 96 ou 24 poços por 48 a 72 horas. 48 a 72 horas após o isolamento, descongele uma alíquota do vírus.
Vórtice a amostra, e armazená-la no gelo. Resuspend as células bursais primárias no meio IMDM. Pegue uma alíquota de 10 microliter da suspensão celular e adicione-a a 10 microliters de uma solução azul Trypan.
Em seguida, determine o número de células e viabilidade percentual. Diluir o vírus em 1X complete IMDM para a multiplicidade apropriada de infecção para tornar o vírus inóculo. Misture esta diluição por vórtice.
Centrifugar a suspensão da célula a 400 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, remova o supernatante, e resuspense as células no inóculo do vírus. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora com agitação periódica.
Depois disso, centrifufique a suspensão da célula a 400 vezes g por cinco minutos. Remova o inóculo do vírus e lave as células em mídia IMDM completa 1X. Cultume as células em placas de 96 ou 24 poços.
Neste estudo, as células bursais primárias de frango são sucessivamente cultivadas ex vivo na presença de ligante CD40 de frango solúvel. As células cultivadas na presença de ligante CD40 de frango solúvel aumentam quatro vezes de 902.000 para 3,63 milhões por mililitro durante um período de seis dias. A viabilidade celular também é significativamente melhorada na presença de ligante CD40 de frango.
Em imagens representativas de microscopia confocal, as células infectadas são vistas com fluorescência verde ao redor do núcleo, o que é consistente com a presença de IBDV no citoplasma. Isso é evidente para duas cepas de IBDV, uma variedade adaptada para cultura celular, D78, e uma cepa muito virulenta, UK661. O RNA é então extraído em cinco, 18, 24 e 48 horas após a infecção e submetido ao RT-qPCR com primers específicos para uma região conservada do gene VP4 do IBDV.
A expressão IBDV VP4 é vista para aumentar para 16.603 cópias em 48 horas após a infecção com D78 e para 38.632 cópias em 48 horas de pós-infecção com UK661. Esses dados demonstram que as células bursais primárias de frango podem suportar a replicação de cepas de IBDV adaptadas pela cultura celular e muito virulentas. Após esse procedimento, outros métodos como RT-qPCR, microarray ou RNA-Seq podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como como as células respondem à infecção.
Comparamos como as células respondem à infecção com uma cepa atenuada e uma cepa muito virulenta de IBDV e agora investigando como elas respondem a outras infecções virais. A capacidade de cultivar essas células nos permite estudar aspectos da patogênese do vírus e da imunossupressão sem a necessidade de infectar aves. Isso terá um impacto substancial sobre os três Rs, a substituição, o refinamento e a redução do uso de animais em pesquisas.
