Criando pares de modelos derivados do paciente in vivo/in vitro de PDX e Organoides Derivados de PDX para pesquisa de farmacologia do câncer

Este protocolo pode ser usado para estabelecer uma biblioteca combinada de xenoenxertos derivados do paciente, ou PDX, e linhas organoides derivadas do paciente correspondentes. A vantagem deste método é que ele pode ser usado para criar organoides usando PDX para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Comece colhendo os tumores e processando o tecido conforme descrito no manuscrito do texto.

Após a digestão do tecido, pipeta o tecido para cima e para baixo com uma pipeta plástica estéril de cinco mililitros. Em seguida, adicione 20 mililitros de AD+ao homogeneizar e filtre-o com um filtro de célula de 100 micrômetros. Lave o filtrado duas vezes com AD+, depois transfira-o para um tubo de plástico e centrífugue-o a 450 vezes G durante cinco minutos.

Resuspend as células na BME e mantê-las no gelo. Para preparar a cultura organoide, transfira 200 microlitadores da suspensão celular para cada poço de uma placa de seis poços e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicione dois mililitros de mídia organoide a cada poço e imagem o representante cai sob um microscópio.

Mantenha as culturas organoides a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com alterações médias a cada três ou quatro dias e passagem em uma proporção de um a dois a cada sete dias. Depois de dissociar os organoides, passe-os através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo plástico de 50 mililitros. Conte os organoides sob um microscópio e resuspensá-los em BME no gelo para uma concentração final de 5%Adicione 50 microlitros da suspensão organoide em cada placa de 384 poços com um dispensador líquido para uma densidade de semeadura de 200 PDXOs CR2110 por poço.

Use o distribuidor digital para adicionar SN38 a cada poço em diluição serial. Crie um mapa de placas usando a ferramenta de software do distribuidor digital. Os tratamentos devem incluir um veículo de controle negativo com 100% de viabilidade e controle positivo de cinco micromolares de Staurosporina com 0% de viabilidade.

Quando terminar, coloque as placas de 384 poços tratadas de drogas de volta em incubadora de 37 graus Celsius. Sob microscopia leve, PDXO CR2110 mostra morfologia cística típica demonstrando a semelhança entre organoides derivados do PDX e organoides derivados do paciente sob as mesmas condições culturais. O exame histopatológico pela coloração da H&E revela que as estruturas teciduais e os tipos celulares do PDXO CR2110 são semelhantes ao PDX CR2110 original.

Comparações genômicas de perfil de PDX e PDXO demonstram uma correlação de 94,92% da expressão transcriptome e uma concordância de 97,67% das mutações de DNA, sugerindo uma semelhança genômica global entre este par de modelos. Ensaios de sensibilidade à droga foram realizados em PDXO CR2110 em placas de 384 poços. PDXO CR2110 foi sensível à irinoteca e resistente à cisplatina, consistente com os resultados do tratamento PDX.

O par combinado de modelos in vitro e in vivo pode elogiar uns aos outros pela triagem in vitro e validação in vivo, melhorando a taxa de sucesso da descoberta de medicamentos e potencialmente reduzindo as taxas de atrito no desenvolvimento clínico.