Os organoides derivados de pacientes humanos são sistemas modelos tridimensionais in vitro que representam tanto a diversidade de pacientes quanto a heterogeneidade celular dos tumores. Este protocolo e demonstração em vídeo fornecem um guia detalhado e prático para estabelecer o tumor de mama derivado da paciente e organoides normais. Os organoides de tumor de mama derivados de pacientes são novos modelos empolgantes, mas difíceis de estabelecer.
O protocolo abrangente que fornecemos aqui deve ajudar a preparar os pesquisadores que tentam desenvolver organoides mamários e familiarizá-los com os desafios esperados. Cada linha de DOP derivada de um paciente diferente é única em morfologia e taxa de crescimento. Ao contrário de dois sistemas de linhagem celular 2D, os organoides crescem melhor quando plaqueados em alta densidade, permitindo melhores interações intercelulares.
Quem demonstrará o procedimento será Disha Aggarwal, aluna de pós-graduação em meu laboratório. Para começar, descongele uma garrafa de matriz de membrana basal no gelo ou durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira o tecido ressecado para uma placa de Petri estéril de 10 centímetros.
Examine macroscopicamente o tecido e anote se ele parece morfologicamente gorduroso, vascularizado ou necrótico. Além disso, registre o tamanho e a forma do tecido e tire uma foto do tecido com uma régua à vista. Pique o tecido em pequenos pedaços com um bisturi número 10 estéril e transfira-o para um tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione 10 mililitros de dois miligramas por mililitro de solução de colagenase IV e sele o tubo. Coloque o tubo em um agitador orbital a 37 graus Celsius a 140 RPM por 30 a 90 minutos em um ângulo de 30 graus. Durante a incubação, coloque uma alíquota de meio completo para pré-aquecer a 37 graus Celsius em um talão ou banho-maria.
A cada 15 minutos, ressuspenda o tecido misturando para cima e para baixo vigorosamente usando uma pipeta sorológica pré-revestida estéril de cinco mililitros. Dissociação monitorada ao longo do tempo observando o tubo sob o microscópio em um aumento de 5X ou superior. Uma vez dissociado o tecido, centrifugar a 400 G por cinco minutos, aspirar o sobrenadante e adicionar 10 mililitros de AdDF+Again, centrifugar e aspirar cuidadosamente o sobrenadante, pois os pellets de tecido podem ocasionalmente estar soltos.
Se o pellet de tecido estiver parcialmente vermelho, adicione dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicionar 10 mililitros de AdDF+ ao tubo, centrifugar a 400 G por cinco minutos e descartar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 50 a 300 microlitros de matriz de membrana basal fria não diluída e misturado por pipetagem cuidadosamente para evitar a formação de bolhas.
Usando uma placa de cultura de tecidos de seis poços que é pré-aquecida na incubadora durante a noite, placa de 300 microlitros de cúpula de matriz de membrana basal contendo organoides em cada poço. Deixe a placa intacta no capô por cinco minutos antes de colocá-la a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos para que a cúpula da matriz da membrana basal se solidifique completamente. No final da incubação, adicione três mililitros de meio completo pré-aquecido gota a gota a cada poço e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após a incubação, capture imagens dos organoides usando uma objetiva de 5X em um microscópio de campo claro invertido. Levante a cúpula da matriz da membrana basal para o meio no poço usando um raspador de células ou uma ponta de pipeta de um mililitro. Usando uma ponta de pipeta pré-revestida, transfira a cúpula flutuante dos organoides com tubo cônico médio para um tubo cônico de 15 ou 50 mililitros, dependendo do número de poços sendo colhidos.
Em seguida, adicione DPBS para aumentar o volume para pelo menos cinco mililitros. Gire os tubos a 400 G por cinco minutos. A matriz da membrana basal com organoides forma uma camada no fundo.
Após aspirar o sobrenadante, adicione de 5 a 20 mililitros de DPBS, dependendo do número de poços agrupados em um tubo. Misture o pellet de matriz de membrana basal organoide em DBPS usando uma pipeta descartável estéril pré-revestida. Novamente, centrifugar e descartar o sobrenadante.
Usando uma ponta de pipeta revestida, adicione o reagente de dissociação celular a três vezes o volume da matriz da membrana basal e ressuspenda os organoides. Coloque o tubo em um agitador orbital a 37 graus Celsius a 140 RPM por 8 a 15 minutos em posição angulada. Monitore o tubo observando-o sob o microscópio a cada cinco minutos para garantir que os organoides sejam quebrados em grupos menores.
Adicione AdDF+ a um volume igual ou superior ao reagente de dissociação celular e pipeta para misturar os organoides. Gire a 400 G por cinco minutos para obter uma pastilha organoide. Uma vez obtido um pellet organoide branco sem matriz de membrana basal não dissolvida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de AdDF+Completar o volume para 10 mililitros com AdDF+Gire o tubo para a etapa de lavagem e descarte o sobrenadante.
Adicione a quantidade necessária de matriz de membrana basal aos organoides digeridos com base na proporção de divisão apropriada. Misture pipetando suavemente para cima e para baixo para evitar a criação de bolhas e coloque imediatamente no gelo. Cúpulas de organoides de 300 microlitros ressuspensas em uma matriz de membrana basal em uma placa pré-aquecida de seis poços.
Deixe a placa intacta no capô por cinco minutos antes de colocá-la a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 20 a 30 minutos para que as cúpulas se solidifiquem. Ao final da incubação, e três mililitros de meio completo pré-aquecido para cada poço e colocar a placa de volta na incubadora. Adicione meio fresco completo a cada cinco a sete dias.
As várias linhagens organoides de tumor de mama derivadas de pacientes diferem em morfologia e taxa de crescimento. Os organoides mamários normais e os poucos carcinomas ductais precoces nos organoides derivados de C2 assemelhavam-se à estrutura normal da mama, com lúmen central circundado por células ductais. Organoides derivados de carcinoma lobular invasivo tendem a formar estruturas frouxamente aderidas semelhantes a cachos de uva.
Enquanto isso, organoides derivados de carcinomas ductais invasivos tendem a formar organoides densos, grandes e redondos. O crescimento dos organoides foi medido usando um ensaio de viabilidade celular luminescente nos dias três, seis, nove e 12, com uma leitura basal no primeiro dia após o plaqueamento. As imagens de campo brilhante dos mesmos organoides expandidos ao longo do tempo são mostradas aqui.
Algumas linhas organoides derivadas do paciente têm um tempo de duplicação de dois dias, enquanto outras levam cinco dias. É importante ser paciente com linhas organoides específicas que são lentas para estabelecer. Em nossa experiência, o aumento da densidade de revestimento ou a filtragem de detritos promove o crescimento de DOPs.
Os organoides derivados do paciente, ou DOPs, são excelentes modelos para triagem de drogas. Eles modelam interações célula-célula, bem como célula-matriz extracelular que são fundamentais para estudar a fisiopatologia do câncer. Além disso, as DOPs podem sofrer manipulação genética e podem ser usadas para desenvolver xenoenxertos em sistemas de co-cultura, tornando-os ótimos modelos para estudos mecanísticos.
