A pesquisa foi apoiada por Progetto Ager − Fondazioni em rete per la ricerca agroalimentare. Projeto acrônimo Violino - Valorização de produtos de oliva italianos através de ferramentas analíticas inovadoras (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). O software GC Image está disponível para uma avaliação gratuita para leitores que desejam demonstrar e testar o protocolo.

1. Importação de dados brutos
NOTA: Isso cria uma matriz de raster bidimensional para visualização e processamento.
<ol><li>Inicie o software de imagem.</li>
	<li>Selecione | de arquivos Importação; navegar e escolher o arquivo de dados bruto adquirido pelo sistema GC×GC-TOF MS denominado "VIOLINO 101.lsc"(Arquivo Complementar 1); em seguida, clique em Abrir. O cromatógrafo abre neste software. NOTA: O formato do arquivo de dados bruto depende do fabricante do instrumento. O software importa uma variedade de formatos de arquivo listados no guia do usuário.</li>
	<li>No diálogo Importação, defina o Período de Modulação (PM) para 3,5 s; em seguida, clique em OK. NOTA: Alguns softwares de aquisição podem não registrar o período de modulação.</li>
	<li>Selecione | de arquivos Salvar imagem como; navegar para a pasta desejada; digitar o nome "Oil 1 RAW.gci"(Arquivo Complementar 2); em seguida, clique em Salvar.</li>
</ol>2. Mudar a fase de modulação
NOTA: Isso coloca todos os picos em cada ciclo de modulação na mesma coluna de imagem, incluindo os picos que envolvem o final do período de modulação no tempo nulo do próximo período de modulação20.
<ol><li>Selecione | de processamento Fase de turno.</li>
	<li>No diálogo Fase de turno, defina o Valor do Deslocamento para -0,8 s; em seguida, clique em OK.</li>
</ol>3. Correção da linha debase 21
<ol><li>Selecione | gráfico Desenhar Retângulo.</li>
	<li>Clique e arraste para desenhar um retângulo na imagem onde não são detectados picos.</li>
	<li>Selecionar ferramentas | Visualizar dados; note o desvio médio e padrão do sinal do detector, aqui, 21.850 ± número digital sem unidade SD (DN); em seguida, feche a ferramenta.</li>
	<li>Selecione | de processamento Linha de base correta.</li>
</ol>4. Colorir a imagem cromatográfica usando um mapa de valor e mapa de cores20
<ol><li>Selecione Exibir | Colorize.</li>
	<li>Na caixa de diálogo Colorize, selecione a guia Importação/Exportação; selecionar o mapa de cores personalizado #AAAA (Arquivo Suplementar 3)fornecido como material complementar; em seguida, clique em Importar.</li>
	<li>Nos controles de Mapeamento de Valor, defina a faixa de valor para os valores mínimos e máximos; em seguida, clique em OK.</li>
</ol>5. 2D picos (ou seja, blobs) detecção para analitos18
<ol><li>Selecione | de processamento Detectar blobs com as configurações padrão; em seguida, observe que alguns picos são divididos e há detecções espúrias.</li>
	<li>Selecione Configurar | Configurações | Detecção de bolhas; em seguida, defina suavizar para 0,1 para a primeira dimensão e 2.0 para a segunda dimensão e definir volume mínimo (ou seja, limiar para os valores somados) para 1,00 E6; em seguida, clique em OK.</li>
	<li>Selecione | de processamento Detectar blobs com as novas configurações; então, observe as melhorias.</li>
</ol>6. 2D picos de filtragem
NOTA: Isso é feito para remover automaticamente detecções sem sentido devido a sangramentos de coluna ao longo do 1D e golpes ou rejeitos ao longo do 2D.
<ol><li>Selecione | de processamento Detecção interativa de bolhas.</li>
	<li>Observe as configurações de detecção de bolhas; em seguida, clique em Detectar.</li>
	<li>No construtor do filtro avançado, clique em Adicionar; em seguida, na caixa de diálogo Nova Restrição, selecione Retenção II; em seguida, clique em OK.</li>
	<li>Nos controles deslizantes de restrição, defina os tempos mínimos e máximos de retenção de 2D para o filtro reduzir o número de picos falsos sem perder picos verdadeiros.</li>
	<li>Clique em Aplicar; em seguida, clique em Sim para salvar as configurações de detecção com o novo filtro. NOTA: Ferramentas mais avançadas podem ser necessárias para lidar com problemas de detecção específicos, como detecção de pico de íon ou desconvolução para co-eluções19.</li>
</ol>7. Calibração dos índices de retenção linear
NOTA: Execute esta etapa22 (IT) para os tempos específicos de retenção em todo o conjunto de padrões de índice de retenção (RI) (tipicamente n-alkanes).
<ol><li>Selecione Configurar | | de Mesa RI Índice de Retenção (Col I).</li>
	<li>Na caixa de diálogo Configuração da tabela RI, clique em Importar; em seguida, selecione o arquivo de calibração RI (em formato CSV com nome, tempo de retenção e índice de retenção) chamado "tabela LRI.csv" – (Arquivo Suplementar 4).</li>
	<li>Selecione | de arquivos Salvar imagem A. Navegar até a pasta desejada; digitar o nome "Oil 1 LRI CALIBRATED.gci"(Arquivo Complementar 5); em seguida, clique em Salvar.</li>
</ol>8. Procurando o espectro de pico na biblioteca NIST17 MS23
<ol><li>Selecione Configurar | Configurações | Biblioteca de Pesquisa.</li>
	<li>Na caixa de diálogo da Biblioteca de Pesquisa, defina tipo de espectro para o pico ms, limiar de intensidade para 100, tipo de pesquisa NIST para simples (similaridade), tipo de coluna NIST RI para polar padrão e tolerância de RI NIST a 10; em seguida, clique em OK. O NIST MS Search oferece muitas outras configurações definidas para os padrões aqui.</li>
	<li>Selecione | de processamento Biblioteca de pesquisa para Todos os Blobs.</li>
</ol>9. Revisar e corrigir identificações de analitos
<ol><li>Na paleta de ferramentas, defina o modo cursor para Blob | Selecione Blobs.</li>
	<li>Na exibição Imagem, clique com o botão direito do mouse no pico desejado.</li>
	<li>Na caixa de diálogo Blob Properties, inspecione propriedades de bolhas; em seguida, clique em Lista de Cliques.</li>
	<li>Inspecione a lista de acertos; em seguida, se a identificação estiver incorreta, selecione a marca de verificação ao lado da identificação correta.</li>
	<li>Na caixa de diálogo Blob Properties, digite o Nome do Grupo para designar classe química e quaisquer outros metadados desejados; em seguida, clique em OK.</li>
	<li>Selecione | de arquivos Salvar imagem como; navegar para a pasta desejada; digitar o nome "Óleo 1 COLORIDO para Modelo de construção.gci"(Arquivo Complementar 6); em seguida, clique em Salvar. NOTA: Este arquivo está incluído no arquivo suplementar, que pode ser aberto para a etapa 10.</li>
</ol>10. Crie um modelo com picos direcionados15
<ol><li>Na exibição de imagem (ainda no modo Select Blobs a partir da etapa 9.1), selecione os picos desejados com um clique no primeiro pico e CTRL + clique nos picos adicionais.</li>
	<li>Na paleta de ferramentas, clique no botão Adicionar ao Modelo.</li>
	<li>Quando o modelo estiver concluído, selecione Arquivo | Salvar modelo; especificar a pasta e o nome do arquivo; em seguida, clique em Salvar.</li>
	<li>Selecione | de arquivos Imagem fechada. NOTA: Neste ponto, essas instruções continuam com o modelo criado para incluir os picos de destino desejados, disponíveis como "tamplate.bt direcionados"(Arquivo Complementar 7).</li>
</ol>11. Combine e aplique o modelo
NOTA: A correspondência reconhece o padrão de modelo nos picos detectados um novo cromatograma. Aplicando as identificações dos conjuntos correspondentes e outros metadados no novo cromatograma do modelo.
<ol><li>Selecione | de arquivos Imagem Aberta; navegar e selecionar o arquivo de cromatograma "Oil 2 COLORIZED.gci"(Arquivo Suplementar 8) (que é pré-processado); em seguida, clique em Abrir.</li>
	<li>Na paleta de ferramentas, defina o modo cursor para Modelar | Selecione Objetos.</li>
	<li>Selecione | de modelos Modelo de carga.</li>
	<li>Na caixa de diálogo Modelo de carga, clique em Procurar; navegar e selecionar o modelo de picos direcionados "Targeted template.bt"(Arquivo Suplementar 7); em seguida, clique em Abrir.</li>
	<li>Na caixa de diálogo Modelo de carga, clique em Carregare, em seguida, Descarte.</li>
	<li>Na exibição imagem, clique com o botão direito do mouse em um pico de modelo; em seguida, inspecione suas propriedades de objeto, incluindo o qCLIC e referência MS.</li>
	<li>Selecione | de modelos Modelo interativo de correspondência e transformação.</li>
	<li>Na interface Interactive Match, clique em Match All; em seguida, revise os resultados correspondentes tanto na tabela quanto na imagem, em que cada pico de modelo é marcado com círculos não preenchidos e, se uma correspondência for feita, há um link para um círculo preenchido para o pico detectado.</li>
	<li>Editar as correspondências conforme desejado; quando estiver satisfeito, clique em Aplicar para transferir metadados do modelo para o cromatograma. NOTA: As restrições de correspondência, como a qCLIC, ajudam a corresponder ao padrão correto entre os picos detectados do novo cromatograma. Os parâmetros de restrição incluem o tipo de assinatura ms usada como referência de modelo(pico MS ou blob MS) e os valores limiares para similaridade espectral (Direct Match Factor (DMF) e Reverse Match Factor (RMF)). Aqui, os parâmetros são definidos com base em estudos anteriores13,14 para limitar as correspondências falsas negativas: pico ms e dmf e limite de similaridade RMF 700.</li>
</ol>12. Transforme o modelo para cromatografia substancialmente diferente
NOTA: Esta etapa não é necessária a menos que as condições cromatográficas variem substancialmente fazendo com que o modelo seja desalinhado com um novo cromatógrafo, como pode ser o caso em estudos de longo prazo ou depois que uma nova coluna é instalada. Nesses casos, o modelo pode ser geometricamente transformado no plano de retenção cromatográfica para melhor se encaixar no novo cromatógrafo12,13. Neste exemplo, os padrões de pico do modelo e do cromatograma são semelhantes, mas diferem na geometria dos tempos de retenção, como seria visto para diferentes condições cromatográficas.
<ol><li>Repetir as etapas 11.2-11.5, exceto navegar para, selecionar e carregar 2.bt de modelo direcionado (Arquivo Suplementar 9).</li>
	<li>Selecione | de modelos Modelo de correspondência interativo; em seguida, clique em Editar transformar.</li>
	<li>Na interface Transformar Modelo, varie as escalas 1D e 2D, traduções e tesouras para alinhar melhor o modelo com os picos detectados; em seguida, clique em Transformar modelo.</li>
	<li>Com o modelo transformado, clique em Editar correspondência; em seguida, repita as etapas 11.8-11.9.</li>
</ol>13. Realize análises combinadas não direcionadas e direcionadas em um conjunto de cromatogramas
NOTA: Um modelo combinado não direcionado e direcionado (UT), também referido como modelo de recurso 24,25, quando combinado com cada um de um conjunto de cromatógrafos, estabelece correspondências entre analitos não direcionados e direcionados, em seguida, características consistentes de amostra cruzada são extraídas para padrão de reconhecimento.
<ol><li>Realize a pré-processamento (etapas 1-6) e correspondência de modelo UT (etapas 11.1-11.9) para todos os cromatógramas do conjunto (ou seja, cromatogramas 2D de óleos). Alternativamente, automatize esta etapa com software de projeto ou software semelhante, não descrito aqui.</li>
	<li>Inicie o software Investigator.</li>
	<li>Selecione | de arquivos Análise aberta; em seguida, selecione e abra "Feature Jove su 70 eV.gca"(Arquivo Suplementar 10).</li>
	<li>Clique em OK para abrir e examinar os resultados.</li>
	<li>Clique na guia Compostos para revisar valores métricos e estatísticas para analitos específicos (ou seja, analitos direcionados com nomes químicos associados) ou analitos não direcionados com identificadores (#) alinhados em todos os cromatogramas e, em seguida, execute as etapas abaixo.<ol>
<li>Clique na guia Atributos para revisar valores e estatísticas para métricas específicas em cromatogramas.</li>
		<li>Clique na guia Resumo para revisar as estatísticas de resumo de compostos e recursos. Se os cromatógrafos são de classes diferentes, como neste caso os óleos produzidos a partir de azeitonas colhidas em duas regiões diferentes da Itália, então a guia Resumo lista as estatísticas da razão de Fisher (F e FDR), que fornecem insights sobre características para discriminar entre classes.</li>
		<li>Visualize vários gráficos em todas as guias e, se desejar, execute a Análise de Componentes Principais (PCA) na guia Atributos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>14. Modifique o modelo UT para análise paralela de MS
NOTA: A análise foi realizada com 70 eV e 12 eV (ou seja, altas e baixas) energias de ionização eletrônica26,27.
<ol><li>Abra um dos cromatógrafos de 12 eV, por exemplo, "Oil 1 12 eV RAW.gci"(Arquivo Suplementar 11),realize o pré-processamento (etapas 1-6) e carregue o modelo UT "modelo UT 70 relaxed.bt"(Arquivo Suplementar 12), conforme descrito nas etapas 11.1-11.6. Os arquivos são fornecidos como material complementar.</li>
	<li>Se necessário, ajuste o modelo para se encaixar nos picos detectados de 12 eV conforme descrito na etapa 12. Aqui, não há desalinhamento significativo porque os sinais tandem são multiplexados. No entanto, deve-se notar que, como as diferentes configurações de ionização produzem diferentes fragmentações, é necessário relaxar as restrições para as restrições qCLIC sobre a similaridade espectral DMF e RMF (não demonstradas aqui).</li>
	<li>Selecione | de arquivos Salvar modelo; especificar a pasta e o nome do arquivo, por exemplo, "modelo UT 12.bt"(Arquivo Complementar 13); em seguida, clique em Salvar.</li>
</ol>15. Realize análises combinadas não direcionadas e direcionadas em 12 cromatogramas eV
<ol><li>Selecione | de arquivos Análise aberta; em seguida, selecione e abra "Feature Jove su 12 eV.gca" - Arquivo suplementar 14 fornecido.</li>
	<li>Clique em OK para abrir e examinar os resultados.</li>
	<li>Clique na guia Compostos para revisar os valores métricos, consulte 12 respostas eV e estatísticas para analitos específicos (ou seja, analitos direcionados com nomes químicos associados) ou analitos não direcionados com identificadores (#) alinhados em todos os cromatógramas e, em seguida, execute as etapas abaixo.<ol>
<li>Clique na guia Atributos para revisar valores e estatísticas para métricas específicas em cromatogramas.</li>
		<li>Clique na guia Resumo para revisar as estatísticas de resumo de ambos os compostos e recursos em 12 eV. Se os cromatógrafos são de classes diferentes, como neste caso os óleos produzidos a partir de azeitonas colhidas em duas regiões diferentes da Itália, então a guia Resumo lista as estatísticas da razão de Fisher (F e FDR), que fornecem insights sobre características para discriminar entre classes.</li>
		<li>Visualize os vários gráficos disponíveis em todas as guias e, se desejar, execute a Análise de Componentes Principais (PCA) na guia Atributos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tranchida, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+comprehensive+chromatography+in+food+analysis.">Potential of comprehensive chromatography in food analysis.</a> Trends in Analytical Chemistry. 52, 186-205 (2013).</li><li>Cordero, C., Kiefl, J., Reichenbach, S. E., Bicchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+odorant+patterns+by+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography:+A+challenge+in+omic+studies.">Characterization of odorant patterns by comprehensive two-dimensional gas chromatography: A challenge in omic studies.</a> Trends in Analytical Chemistry. 113, 364-378 (2019).</li><li>Cordero, C., Kiefl, J., Schieberle, P., Reichenbach, S. E., Bicchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+and+food+sensory+properties:+potential+and+challenges.">Comprehensive two-dimensional gas chromatography and food sensory properties: potential and challenges.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 169-191 (2015).</li><li>Adahchour, M., Beens, J., Vreuls, R. J. J., Brinkman, U. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+(GC+&#215;+GC)+-+Introduction+and+instrumental+set-up.">Recent developments in comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC &#215; GC) - Introduction and instrumental set-up.</a> Trends in Analytical Chemistry. 25 (5), 438-454 (2006).</li><li>Prebihalo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gas+chromatography:+Advances+in+instrumentation,+chemometrics,+and+applications.">Multidimensional gas chromatography: Advances in instrumentation, chemometrics, and applications.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 505-532 (2018).</li><li>Cordero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+food+volatiles+by+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry:+advanced+fingerprinting+approaches+for+comparative+analysis+of+the+volatile+fraction+of+roasted+hazelnuts+(Corylus+Avellana+L.)+from+different+origins.">Profiling food volatiles by comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with mass spectrometry: advanced fingerprinting approaches for comparative analysis of the volatile fraction of roasted hazelnuts (Corylus Avellana L.) from different origins.</a> Journal of Chromatography A. 1217, 5848-5858 (2010).</li><li>Cordero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+and+non-targeted+approaches+for+complex+natural+sample+profiling+by+GC&#215;GC-QMS.">Targeted and non-targeted approaches for complex natural sample profiling by GC&#215;GC-QMS.</a> Journal of Chromatography Sciences. 48 (4), 251-261 (2010).</li><li>Maio, D., Maltoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gray-scale+minutiae+detection+in+fingerprints.">Direct gray-scale minutiae detection in fingerprints.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 19 (1), 27-40 (1997).</li><li>Jain, A. K., Hong, L., Pankanti, S., Bolle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+identity-authentication+system+using+fingerprints.">An identity-authentication system using fingerprints.</a> Proceedings of IEEE. 85 (9), 1365-1388 (1997).</li><li>Parsons, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tile-based+fisher+ratio+analysis+of+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+time-of-flight+mass+spectrometry+(GC+&#215;+GC-TOFMS)+data+using+a+null+distribution+approach.">Tile-based fisher ratio analysis of comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (GC &#215; GC-TOFMS) data using a null distribution approach.</a> Analytical Chemistry. 87 (7), 3812-3819 (2015).</li><li>Pierce, K. M., Kehimkar, B., Marney, L. C., Hoggard, J. C., Synovec, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+chemometric+analysis+techniques+for+comprehensive+two+dimensional+separations+data.">Review of chemometric analysis techniques for comprehensive two dimensional separations data.</a> Journal of Chromatography A. 1255, 3-11 (2012).</li><li>Reichenbach, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+for+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+with+dual+secondary+columns+and+detectors.">Alignment for comprehensive two-dimensional gas chromatography with dual secondary columns and detectors.</a> Analytical Chemistry. 87 (19), 10056-10063 (2015).</li><li>Rempe, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+global,+low-degree+polynomial+transformations+for+GCxGC+data+alignment.">Effectiveness of global, low-degree polynomial transformations for GCxGC data alignment.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10028-10035 (2016).</li><li>Stilo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+and+targeted+fingerprinting+of+extra+virgin+olive+oil+volatiles+by+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+with+mass+spectrometry:+challenges+in+long-term+studies.">Untargeted and targeted fingerprinting of extra virgin olive oil volatiles by comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometry: challenges in long-term studies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (18), 5289-5302 (2019).</li><li>Reichenbach, S. E., Carr, P. W., Stoll, D. R., Tao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+templates+for+peak+pattern+matching+with+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography.">Smart templates for peak pattern matching with comprehensive two-dimensional liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (16), 3458-3466 (2009).</li><li>Reichenbach, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informatics+for+cross-sample+analysis+with+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+and+high-resolution+mass+spectrometry+(GCxGC-HRMS).">Informatics for cross-sample analysis with comprehensive two-dimensional gas chromatography and high-resolution mass spectrometry (GCxGC-HRMS).</a> Talanta. 83 (4), 1279-1288 (2011).</li><li>Reichenbach, S. E., Tian, X., Cordero, C., Tao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+for+non-targeted+cross-sample+analysis+with+comprehensive+two-dimensional+chromatography.">Features for non-targeted cross-sample analysis with comprehensive two-dimensional chromatography.</a> Journal of Chromatography A. 1226, 140-148 (2012).</li><li>Latha, I., Reichenbach, S. E., Tao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+peak-detection+techniques+for+comprehensive+two-dimensional+chromatography.">Comparative analysis of peak-detection techniques for comprehensive two-dimensional chromatography.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (38), 6792-6798 (2011).</li><li>Reichenbach, S. E., Tao, Q., Cordero, C., Bicchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+data-challenge+case+study+of+analyte+detection+and+identification+with+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+with+mass+spectrometry+(GC&#215;GC-MS).">A data-challenge case study of analyte detection and identification with comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometry (GC&#215;GC-MS).</a> Separations. 6 (3), 38 (2019).</li><li>Reichenbach, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Data+Acquisition,+Visualization,+and+Analysis.">Chapter 4 Data Acquisition, Visualization, and Analysis.</a> Comprehensive Analytical Chemistry. , 77-106 (2009).</li><li>Reichenbach, S. E., Ni, M., Zhang, D., Ledford, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+background+removal+in+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography.">Image background removal in comprehensive two-dimensional gas chromatography.</a> Journal of Chromatography A. 985 (1-2), 47-56 (2003).</li><li>Kratz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalization+of+the+retention+index+system+including+linear+temperature+programmed+gas-liquid+partition+chromatography.">A Generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography.</a> Journal of Chromatography A. 11, 463-471 (1963).</li><li>NIST Mass Spectrometry Data Center. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIST+Standard+Reference+Database+1A:+NIST/EPA/NIH+Mass+Spectral+Library+(NIST+08)+and+NIST+Mass+Spectral+Search+Program+(Version+2.0f).">NIST Standard Reference Database 1A: NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (NIST 08) and NIST Mass Spectral Search Program (Version 2.0f).</a> National Institute of Standards and Technology (NIST). , (2005).</li><li>Magagna, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+untargeted+and+targeted+fingerprinting+with+comprehensive+two-dimensional+chromatography+for+volatiles+and+ripening+indicators+in+olive+oil.">Combined untargeted and targeted fingerprinting with comprehensive two-dimensional chromatography for volatiles and ripening indicators in olive oil.</a> Analytica Chimica Acta. 936, 245-258 (2016).</li><li>Reichenbach, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+machine+learning+methods+for+comprehensive+chemical+fingerprinting+and+pattern+recognition.">Benchmarking machine learning methods for comprehensive chemical fingerprinting and pattern recognition.</a> Journal of Chromatography A. 1595, 158-167 (2019).</li><li>Ciali&#232; Rosso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+extra-dimensions+to+hazelnuts+primary+metabolome+fingerprinting+by+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+combined+with+time-of-flight+mass+spectrometry+featuring+tandem+ionization:+insights+on+the+aroma+potential.">Adding extra-dimensions to hazelnuts primary metabolome fingerprinting by comprehensive two-dimensional gas chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry featuring tandem ionization: insights on the aroma potential.</a> Journal of Chromatography A. 1614 (460739), 1-11 (2020).</li><li>Cordero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+coupled+with+time+of+flight+mass+spectrometry+featuring+tandem+ionization:+challenges+and+opportunities+for+accurate+fingerprinting+studies.">Comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with time of flight mass spectrometry featuring tandem ionization: challenges and opportunities for accurate fingerprinting studies.</a> Journal of Chromatography A. 1597, 132-141 (2019).</li><li>Ni, M., Reichenbach, S. E., Visvanathan, A., TerMaat, J., Ledford, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+pattern+variations+related+to+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography+acquisition.">Peak pattern variations related to comprehensive two-dimensional gas chromatography acquisition.</a> Journal of Chromatography A. 1086, 165-170 (2005).</li><li>Reichenbach, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+peak+selection+for+multisample+analysis+with+comprehensive+two-dimensional+chromatography.">Reliable peak selection for multisample analysis with comprehensive two-dimensional chromatography.</a> Analytical Chemistry. 85 (10), 4974-4981 (2013).</li><li>Markes International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Select-EV:+The+next+Generation+of+Ion+Source+Technology.">Select-EV: The next Generation of Ion Source Technology.</a> Technical Note. , (2016).</li><li>Tao, Q., Reichenbach, S. E., Heble, C., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+investigator+tools+for+finding+unique+and+common+components+in+multiple+samples+with+comprehensive+two-dimensional+chromatography.">New investigator tools for finding unique and common components in multiple samples with comprehensive two-dimensional chromatography.</a> Chromatography Today. , (2018).</li><li>Seeley, J. V., Seeley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gas+chromatography:+fundamental+advances+and+new+applications.">Multidimensional gas chromatography: fundamental advances and new applications.</a> Analytical Chemistry. 85 (2), 557-578 (2013).</li><li>Tranchida, P. Q., Aloisi, I., Giocastro, B., Mondello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+comprehensive+two-dimensional+gas+chromatography-mass+spectrometry+with+focus+on+processes+of+ionization.">Current state of comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry with focus on processes of ionization.</a> Trends in Analytical Chemistry. 105, 360-366 (2018).</li></ol>

O Prof. Stephen E. Reichenbach e o Dr. Qingping Tao têm interesses financeiros na GC Image, LLC. Daniela Peroni é funcionária da SRA Instruments, distribuidora da GC Image na Itália e na França. Dr. Federico Stilo, Prof. Chiara Cordero, e Prof. Carlo Bicchi não declaram conflitos de interesse.

A visualização dos dados gc×GC-TOF MS é um passo fundamental para uma compreensão adequada dos resultados alcançados por separações bidimensionais abrangentes. Gráficos de imagem com coloração personalizada permitem aos analistas apreciar diferenças de resposta ao detector e, assim, a distribuição diferencial dos componentes amostrais. Essa abordagem visual muda completamente a perspectiva dos analistas sobre a interpretação e elaboração de cromatogramas. Este primeiro passo, uma vez compreendido e usado com confiança pelos cromatógrafos, abre uma nova perspectiva no processamento posterior.
Outro aspecto fundamental do processamento de dados é a acessibilidade à matriz completa de dados (ou seja, dados e respostas espectrais de MS) para todos os pontos amostrais, cada um dos quais corresponde a um único evento detector. Neste sentido, 2D picos de integração, de modo que a coleta de eventos detectores correspondentes a um único analito representam um passo crítico. No protocolo atual, a detecção de picos 2D é baseada no algoritmo da bacia hidrográfica18 com algumas adaptações incluídas para melhorar a sensibilidade de detecção em caso de compostos de co-eluição parcial. Para tornar esse processo mais específico, deve-se fazer a desconvolução e procedimentos mais sofisticados adotados. Isso é possível realizando uma detecção de pico de íons para dados de MS; o algoritmo processa o conjunto de dados e isola a resposta de analitos únicos com base nos perfis espectrais19,31.
Um passo importante, porém crítico, do protocolo, e de qualquer processo de interpretação de dados GC×GC-MS, diz respeito à identificação de analitos. Este procedimento, proposto nas etapas 8 e 9, na ausência de uma análise confirmatória com padrões autênticos, deve ser cuidadosamente conduzido pelo analista. Ações automatizadas estão disponíveis em qualquer software comercial; incluem avaliação de similaridade de assinatura espectral de MS em relação ao espectro de referência coletado (ou seja, bibliotecas espectrais) e avaliação de razões características entre íons qualificados/quantificadores. No entanto, são necessários critérios confirmatórios adicionais para desambiguar a identificação de isômeros. O protocolo propõe a adoção de índices de retenção linear para priorizar a lista de candidatos; o limite aqui diz respeito à disponibilidade de dados de retenção e sua consistência.
A principal característica que torna essa abordagem única é o modelo correspondente12,13,15,29. A correspondência de modelos permite o reconhecimento de padrão 2Dde forma muito eficaz, específica e intuitiva. Pode ser definido, em termos de sensibilidade e especificidade, aplicando valores de limiar personalizados e/ou funções de restrição, enquanto o analista pode supervisionar o procedimento interagindo ativamente com parâmetros de função de transformação. A peculiaridade desse processo baseia-se na possibilidade de cruzar informações de picos direcionados e não direcionados entre amostras de um lote uniforme, mas também entre amostras adquiridas com as mesmas condições nominais, apesar do desalinhamento médio-grave. As vantagens desta operação dizem respeito à possibilidade de preservar todas as identificações de analitos direcionados, que é uma tarefa demorada para o analista, e todos os metadados salvos para picos direcionados e não segmentados de sessões de elaboração anteriores.
A correspondência de modelos também é muito eficaz em termos de tempo computacional; Os arquivos de dados MS de baixa resolução consistem em cerca de 1-2 Gb de dados embalados, enquanto as análises de MS de alta resolução podem chegar a 10-15 Gb por execução analítica única. A correspondência de modelos não processa a matriz de dados completa todas as vezes, mas, a princípio, realiza o alinhamento do tempo de retenção entre os cromatógrafos usando picos de modelo, então, processa picos de candidatos dentro da janela de pesquisa para sua correspondência de semelhança com referência no modelo. Em caso de grave desalinhamento, a situação mais desafiadora, as transformações polinomiais globais de segunda ordem tiveram um desempenho melhor do que os métodos locais, reduzindo o tempo computacional13.
Para que a técnica GC×GC se espalhe amplamente além da academia e dos laboratórios de pesquisa, as ferramentas de processamento de dados devem facilitar operações básicas para visualização e inspeção de cromatógrafos; a identificação de analitos deve oferecer a possibilidade de adotar algoritmos e procedimentos padronizados (por exemplo, algoritmo de pesquisa NIST e calibração IT); e a análise interativo deve ser intuitiva, eficaz e suportada por ferramentas interativas. A abordagem proposta aborda essas necessidades ao mesmo tempo em que oferece opções e ferramentas avançadas para lidar com situações complexas, como co-elução de analitos, calibração de vários analitos, análise do tipo de grupo e alinhamento paralelo de detecção.
O poço de literatura referenciada abrange muitos cenários possíveis onde o GC×GC e, mais geralmente, a cromatografia bidimensional abrangente, oferecem soluções únicas e resultados confiáveis que não podem ser alcançados pela cromatografia 1D na análise de execução única. 5,32,33 Embora o GC×GC seja a ferramenta mais poderosa que aumenta a capacidade de separação e sensibilidade, há sempre limitações ao poder de separação, sensibilidade e outras capacidades sistêmicas. À medida que esses limites sistêmicos são abordados, a análise dos dados torna-se progressivamente mais difícil. Portanto, a pesquisa e o desenvolvimento devem continuar a melhorar as ferramentas analíticas à nossa disposição.

A cromatografia abrangente do gás bidimensional combinada com a detecção espectrométrica de massa de tempo de voo (GC×GC-TOF MS) é hoje a abordagem analítica mais informativa para a caracterização química de amostras complexas1,2,3,4,5. Em GC×GC, as colunas são conectadas serialmente e interfacedas por um modulador (por exemplo, uma interface de foco térmica ou baseada em válvula) que prende componentes de eluição da coluna primeira dimensão(1D) antes de sua reinjeção na coluna segunda dimensão(2D). Esta operação é feita dentro de um período de tempo de modulação fixa(PM),geralmente variando entre 0,5-8 s. Pela modulação térmica, o processo inclui crio-trapping e foco da banda de eluição com alguns benefícios para o poder de separação global.
Embora o GC×GC seja uma técnica de separação bidimensional, o processo produz valores de dados sequenciais. O conversor detector analógico-digital (A/D) obtém a saída de sinal cromatográfico em uma determinada frequência. Em seguida, os dados são armazenados em formatos proprietários específicos que não só contêm os dados digitalizados, mas também metadados relacionados (informações sobre os dados). O conversor A/D empregado em sistemas GC×GC ajuda no mapeamento da intensidade do sinal cromatográfico para um número digital (DN) em função do tempo nas duas dimensões analíticas. Detectores de canal único (por exemplo, detector de ionização de chamas (FID), detector de captura de elétrons (ECD), detector de quimiominascência de enxofre (SCD), etc.) produzem valores únicos por tempo de amostragem, enquanto detectores multicanais (por exemplo, detector espectrométrico de massa (MS)) produzem múltiplos valores (tipicamente, ao longo de uma faixa espectral) por tempo de amostragem ao longo da execução analítica.
Para visualizar dados 2D, a elaboração começa com a rasterização de um único período de modulação (ou ciclo) valores de dados como uma coluna de pixels (elementos de imagem correspondentes a eventos do detector). Ao longo da ordinação (eixo Y, de baixo para cima) o tempo de separação 2Dé visualizado. As colunas pixel são processadas sequencialmente para que a abscissa (eixo X, da esquerda para a direita) reporte tempo de separação 1D. Esta ordem apresenta os dados 2D em um sistema de coordenadas cartesiano destro, com o ordinal de retenção 1D como o primeiro índice na matriz.
O processamento de dados de cromatografias 2D dá acesso a um nível mais alto de informação do que os dados brutos, permitindo detecção de picos em 2D,identificação de pico, extração de dados de resposta para análise quantitativa e análises intercompativas.
Os padrões de pico 2D podem ser tratados como a impressão digital única da amostra e compostos detectados como características de minúcias para uma análise transversal eficaz. Esta abordagem, conhecida como impressão digital baseada em modelo6,7, foi inspirada na impressão digital biométrica6. Os sistemas automáticos de verificação de impressões digitais biométricas, na verdade, contam com características únicas da ponta dos dedos: bifurcações e terminações de cume, localizadas e extraídas de impressões com tinta ou imagens detalhadas. Essas características, denominadas características minúcias, são então combinadas com os modelos armazenados disponíveis8,9.
Como mencionado acima, cada padrão de separação GC×GC é composto de picos 2D racionalmente distribuídos sobre um plano bidimensional. Cada pico corresponde a um único analito, tem seu potencial informativo, e pode ser tratado como uma única característica para análise de padrões comparativos.
Aqui, apresentamos uma abordagem eficaz para impressão digital química pela GC×GC-TOF MS com ionização tandem. O objetivo é catalogar de forma abrangente e quantitativa os recursos de um conjunto de cromatogramas.
Em comparação com o software comercial existente ou rotinas internas10,11 que empregam uma abordagem de pico de recursos, a impressão digital baseada em modelo é caracterizada por alta especificidade, eficiência e tempo computacional limitado. Além disso, possui uma flexibilidade intrínseca que permite o alinhamento transversal das características da minúcia (ou seja, picos 2D) entre cromatógramas severamente desalinhados como os adquiridos por diferentes instrumentações ou em estudos de longo prazo12,13,14.
As operações básicas do método proposto são descritas brevemente para orientar o leitor a uma boa compreensão da complexidade do padrão 2De do poder da informação. Em seguida, explorando a matriz de dados de saída do instrumento, a identificação química é realizada e conhecidos analitos direcionados localizados sobre o espaço bidimensional. O modelo de picos direcionados é então construído e aplicado a uma série de cromatógrafos adquiridos dentro do mesmo lote analítico. Metadados relacionados aos tempos de retenção, assinaturas espectrais e respostas (absolutas e relativas) são extraídos de padrões relin alinhados de picos direcionados e adotados para revelar diferenças composicionais no conjunto amostral.
Como uma etapa adicional e única do processo, uma impressão digital combinada não direcionada e direcionada (UT) também é realizada em cromatógrafos pré-direcionados para estender o potencial de impressão digital a analitos conhecidos e desconhecidos. O processo produz um modelo UT para uma análise comparativa verdadeiramente abrangente que pode ser amplamente automatizada.
Como etapa final, o método realiza o cross-alignment de características em dois sinais de detector paralelo produzidos com energias de ionização eletrônica alta e baixa (70 e 12 eV).
O protocolo é bastante flexível em análises de suporte de um único cromatograma ou um conjunto de cromatgramas e com cromatografia variável e/ou detectores múltiplos. Aqui, o protocolo é demonstrado com um conjunto de software GC×GC (ver Tabela de materiais)combinado a uma biblioteca e software de pesquisa de MS (ver Tabela de Materiais). Algumas das ferramentas necessárias estão disponíveis em outros softwares e ferramentas similares poderiam ser implementadas independentemente a partir de descrições na literatura por Reichenbach e colegas de trabalho15,16,17,18,19. Os dados brutos para a demonstração são derivados de um estudo sobre óleo extravirgem de oliva (EVO) realizado no laboratório dos autores14. Em particular, a fração volátil (ou seja, volatilome) dos óleos evo italianos é amostrada por microextração de fase sólida do headspace (HS-SPME) e analisada por GC×GC-TOF MS para capturar impressões digitais diagnósticas para qualidade e qualificação sensorial das amostras. Detalhes sobre amostras, condições de amostragem e configuração analítica são fornecidos na Tabela de Materiais.
As etapas 1-6 descrevem o pré-processamento dos cromatógrafos. As etapas 7-9 descrevem o processamento e a análise de cromatogramas individuais. As etapas 10-12 descrevem a criação e correspondência do modelo, que são a base para a análise entre amostras. As etapas 13-16 descrevem a aplicação do protocolo em um conjunto de cromatógrafos, com etapas 14-16 para análise ut.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m &#215; 0.25 mm dc &#215; 0.25 &#956;m df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min.</td>
			<td>Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia</td>
			<td>PN 054796</td>
			<td>Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40&#176;C (2 min) to 240&#176;C (10 min) at 3.5&#176;C/min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m &#215; 0.1 mm dc &#215; 0.10 &#956;m df) from .</td>
			<td>Mega, Legnano, Milan, Italy</td>
			<td>PN MEGA-1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC</td>
			<td>SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy</td>
			<td>Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)</td>
			<td></td>
			<td>Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the &#34;Violin&#34; project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph: Model 7890B GC</td>
			<td>Agilent Technologies Wilmington DE, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC Image GC&#215;GC edition V 2.9</td>
			<td>GC Image LLC, Lincoln, Nebraska</td>
			<td></td>
			<td>https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>GC Image LLC, Lincoln, Nebraska</td>
			<td></td>
			<td>https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer: BenchTOF-Select</td>
			<td>Markes International Llantrisant, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)</td>
			<td>Merck-Millipore/Supelco</td>
			<td>PN: 68982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modulator controller: Optimode v2.0</td>
			<td>SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modulator: KT 2004 loop type</td>
			<td>Zoex Corporation Houston, TX, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3</td>
			<td>National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD</td>
			<td></td>
			<td>https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-alkanes C8-C40 for retention indexing</td>
			<td>Merck-Millipore/Supelco</td>
			<td>PN: 40147-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv</td>
			<td>Merck-Millipore/Supelco</td>
			<td>PN: 100795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid Phase Microextraction fiber</td>
			<td>Merck-Millipore/Supelco</td>
			<td>PN 57914-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;- /&#946;-thujone (CAS 546-80-5)</td>
			<td>Merck-Millipore/Sigma Aldrich</td>
			<td>PN: 04314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatographic fingerprinting by template matching for data collected by comprehensive two-dimensional gas chromatography

O processamento e a avaliação dos dados são etapas críticas da cromatografia abrangente do gás bidimensional (GCxGC), particularmente quando acopladas à espectrometria de massa. As informações ricas criptografadas nos dados podem ser altamente valiosas, mas difíceis de acessar eficientemente. A densidade e a complexidade dos dados podem levar a longos tempos de elaboração e exigem procedimentos laboriosos e dependentes de analistas. Ferramentas eficazes e acessíveis de processamento de dados, portanto, são fundamentais para permitir a disseminação e aceitação dessa técnica multidimensional avançada em laboratórios para uso diário. O protocolo de análise de dados apresentado neste trabalho utiliza impressão digital cromatográfica e correspondência de modelos para alcançar o objetivo de desconstrução altamente automatizada de cromatatogramas bidimensionais complexos em características químicas individuais para reconhecimento avançado de padrões informativos dentro de cromatógrafos individuais e em conjuntos de cromatógrafos. O protocolo oferece alta consistência e confiabilidade com pouca intervenção. Ao mesmo tempo, a supervisão dos analistas é possível em uma variedade de configurações e funções de restrição que podem ser personalizadas para fornecer flexibilidade e capacidade de se adaptar a diferentes necessidades e objetivos. A correspondência de modelos é mostrada aqui como uma abordagem poderosa para explorar volatilome de azeite extravirgem. O alinhamento cruzado de picos é realizado não apenas para alvos conhecidos, mas também para compostos não direcionados, o que aumenta significativamente o poder de caracterização para uma ampla gama de aplicações. Exemplos são apresentados para evidenciar o desempenho para a classificação e comparação de padrões cromatográficos a partir de conjuntos amostrais analisados em condições semelhantes.

Os padrões GC×GC-TOF MS de volatilome extravirgem de alta qualidade exibem cerca de 500 picos de 2D acima de um limiar de relação sinal-ruído (SNR) de 100. Tal limiar foi definido por investigações anteriores sobre os voláteis alimentares14,27 como o sinal relativo mínimo sobre o limiar para obter espectros confiáveis para análises interativas. Os componentes são distribuídos sobre o espaço cromatográfico de acordo com sua retenção relativa nas duas dimensões cromatográficas, e especificamente com base em sua volatilidade/polaridade no 1D e volatilidade no 2D. Aqui, a combinação de coluna é polar × semi-polar (ou seja, Carbowax 20M × OV1701).
O padrão 2Dmostra um alto grau de ordem. Padrões de retenção relativa para séries e classes homólogos são mostrados na Figura 1A com anotações (gráficos para grupos e bolhas para picos) para hidrocarbonetos saturados lineares (preto), hidrocarbonetos insaturados (amarelo), aldeídos lineares saturados (azul), aldeídos mono-insaturados (vermelho), aldeídos poli-insaturados (salmão), álcoois primários (verde) e ácidos graxos de cadeia curta (cyano).
Os picos 2D detectados podem então ser identificados comparando o espectro médio de MS extraído de todo o pico 2D (espectroblob) ou do maior espectro (espectroápice). A Figura 2 ilustra a saída do espectro ápice de busca por blob 5 e retorna uma partida de alta semelhança (primeiros 10 hits) para (E)-2-hexenal. Os bancos de dados explorados são aqueles pré-selecionados pelo analista na etapa 8 do método.
A identificação é validada pela indexação de retenção ativa. O valor experimental IT foi calculado para os picos 2D, de modo que nesta fase a pesquisa da biblioteca prioriza resultados com valores coerentes de T tabulado. As janelas de tolerância podem ser personalizadas com base na experiência dos analistas, confiabilidade dos valores do banco de dados de referência de acordo com a fase estacionária e as condições analíticas aplicadas. Novas ferramentas para calibração inteligente de índices de retenção linear sem calibração experimental com n-alkanes, foram recentemente desenvolvidas e discutidas em um estudo de Reichenbach et al19.
A coleção de picos identificados em 2D (ou seja, picos direcionados) pode ser adotada para construir um modelo de picos direcionados para estabelecer prontamente correspondências confiáveis entre o mesmo composto em todos os cromatogramas amostrais. A coleção de picos de modelos direcionados é visualizada na Figura 1B. Os círculos vermelhos correspondem aos 196 compostos-alvo, incluindo dois Padrões Internos (IS) ligados a picos de modelo com linhas de conexão. Os IS são usados para normalização de resposta e as linhas de conexão ajudam a visualizar qual dos IS incluídos será adotado para normalizar cada resposta de pico/bolha 2D.
Na Figura 1B,círculos preenchidos indicam correspondências positivas entre o pico do modelo e o padrão real, enquanto os círculos vazios são para picos de modelo para os quais a correspondência não foi verificada. As correspondências negativas falsas podem ser limitadas pela seleção adequada de parâmetros de limiar, espectro de referência e funções de restrição13,14,18,19. Para padrões complexos com múltiplas co-eluções, as funções de detecção de pico de íons baseadas na desconvolução espectral são aconselháveis e podem ser uma opção válida19. Os metadados de pico do modelo são mostrados no painel ampliado da Figura 1B para (E)-2-hexenal.
A especificidade da correspondência de modelos baseia-se na possibilidade de aplicar funções de restrição que limitam a correspondência positiva aos picos do candidato que, caindo dentro da janela de pesquisa do algoritmo, têm similaridade espectral de MS acima de um determinado limiar. Neste caso, na etapa 11, os limites de similaridade23 foram fixados em 700 de acordo com experimentos anteriores destinados a definir parâmetros ideais que limitam falsas partidas negativas14. As áreas destacadas das propriedades de pico do modelo na Figura 1B mostram as informações sobre a sequência de espectro MS de referência e a função de restrição qCLIC (ou seja, (Match("<ms>") >= 700,0) e (RMatch ("<ms>") >= 700,0)).
Aplicando o modelo a todos os cromatogramas de um conjunto, pode-se encontrar situações desafiadoras como no caso de desalinhamento parcial de padrões. Isso pode ser devido a inconsistências de temperatura do forno, instabilidades de fluxo/pressão do gás transportador, ou por causa de uma intervenção manual no sistema, como no caso de substituição da coluna ou substituição moduladora de loop-capilar14,28. A Figura 3 mostra uma situação de desalinhamento parcial entre o modelo alvo e o cromatograma real. Para desalinhamentos mínimos, as transformações de modelo interativas(Figura 3,painel de controle) podem reposicionar picos de modelo para um melhor ajuste. Uma vez reposicionado, o modelo pode ser combinado para estabelecer correspondências. No exemplo, o modelo(Figura 3,passo 12) bate corretamente com o padrão 2D real. Em caso de desalinhamentos graves, não discutidos aqui, a repetição de ações de atualização de match-transform pode adaptar iterativamente a posição do modelo ao padrão de pico real12,13,14.
Aqui, os picos direcionados (ou seja, analitos conhecidos) fornecem cerca de 40% do resultado cromatográfico (196 picos direcionados de cerca de 500 picos detectáveis em média). Os outros 60% dos compostos, juntamente com as informações que trazem, não são levados em consideração na análise-alvo. Para tornar a investigação verdadeiramente abrangente, também deve ser estabelecido um alinhamento cruzado consistente de picos 2D não-alvos. A primeira aplicação onde a correspondência de modelos foi estendida a todos os analitos detectáveis tratou do volatilome complexo do café torrado7. Esse processo é automatizado com um software (por exemplo, Investigador), mostrado aqui nas etapas 14-15.
Nesse processo, imagens pré-direcionadas pertencentes à amostra definida em estudo (20 amostras) são usadas para definir picos confiáveis, cruzando todos os padrões de imagem29. Posteriormente, é construído um cromatógrafo composto a partir do qual se pode identificar picos e regiões de pico confiáveis ut (ou seja, pegada de picos 2D) no chamado modelo de recurso17.
Para análises adquiridas a 70 eV, o processo determinou 144 picos confiáveis com confiabilidade relaxada29, dos quais 76 pertencem à lista de picos alvo. Com base nesses 144 picos confiáveis, o processo alinha todos os cromatógrafos consistentemente com os tempos médios de retenção dos picos confiáveis e, em seguida, combina-os para criar um cromatógrafo composto. A Figura 4 mostra uma lista de todas as amostras rotuladas de acordo com a região de produção do óleo (esquerda) e a lista de picos confiáveis/volumes de bolhas em cada amostra (à direita).
O modelo de recurso não direcionado é composto por picos 2D de analitos detectados no cromatógrama composto, mostrado na Figura 5A, que são combinados pelo modelo de picos confiáveis (n = 168 – círculos vermelhos para picos direcionados e círculos verdes para picos não direcionados). Os espectros de massa dos picos compostos, bem como seus tempos de retenção, são registrados no modelo de recurso, como mostrado para (Z)-3-hexenol acetato na área ampliada. As regiões de pico são mostradas na Figura 5B como gráficos de cor vermelha; em vez disso são definidos pelos contornos de todos os picos 2D detectados no cromatograma composto (n = 3578).
Quando o reconhecimento de padrão não supervisionado pela Análise de Componentes Principais é aplicado à distribuição de picos direcionados dentro das 20 amostras analisadas, os óleos sicilianos e toscanos agrupam-se separadamente sugerindo que as condições pedo-climáticas e o terroir impactam a prevalência relativa de voláteis. Os resultados são mostrados na Figura 6A e os resultados do PCA da distribuição de picos confiáveis são mostrados na Figura 6B. As duas abordagens validam que óleos de diferentes áreas geográficas têm assinaturas químicas diferentes, enquanto coerentes, sejam compostos direcionados ou não, ou ambos, são mapeados.
Finalmente, o software permite o reequemento imediato e eficaz de padrões em canais de detecção paralelos. Nesta aplicação, o re-alinhamento é proposto para sinais de ionização tandem. A fonte de íons dos multiplexes de MS entre duas energias de ionização (ou seja, 70 e 12 eV) em uma frequência de aquisição de 50 Hz por canal30. Os dois padrões cromatógrafos resultantes estão intimamente alinhados, enquanto os dados espectrais (ou seja, assinaturas e respostas espectrais) trazem informações complementares com diferentes faixas dinâmicas de resposta26,27. Os padrões alinhados permitem recursos de extração (picos2D e regiões-pico) com IDs univocal (ou seja, nomes químicos para picos direcionados e numeração única # para picos não direcionados e regiões-pico).
A correspondência de modelos permite um alinhamento cruzado eficaz. Nesta situação, não há muito desalinhamento, mas as restrições de MS devem ser relaxadas para permitir partidas para picos UT. Por outro lado, as regiões de pico da UT, que não têm restrições de MS, são prontamente combinadas sem correspondências falsas negativas. A Figura 5C mostra uma área ampliada de um cromatograma de 12 eV onde o modelo de recurso construído a partir de 70 dados eV é combinado. Os picos de UT confiáveis são positivamente combinados devido às restrições qCLIC reduzidas (por exemplo, limiar de DMF em 600). Note-se que, a 12 eV, há menos picos detectados devido à fragmentação limitada induzida pela baixa energia de ionização.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig01.jpg"> Figura 1: Gráfico de contorno bidimensional e modelo direcionado. (A) Gráfico de contorno da fração volátil de um azeite extravirgem da Toscana. Padrões ordenados de séries e classes homólogas são destacados com diferentes cores e linhas: hidrocarbonetos saturados lineares (linha preta e contornos 2D)hidrocarbonetos insaturados (amarelo), aldeídos saturados lineares (azul) aldeídos mono-insaturados (vermelho), aldeídos poli-insaturados (salmão), álcoois primários (verde) e ácidos graxos de cadeia curta (ciano). (B) Modelo direcionado sobreposto de analitos conhecidos (círculos de cor vermelha) com linhas de conexão que ligam Normas Internas (ISs). Os painéis mostram as propriedades de pico/bolha de 2D (Decanal) ou propriedades de pico de modelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig02.jpg"> Figura 2: Pesquisa apex MS. Saída do ápice MS busca por blob 5. Lista das entradas do banco de dados com a maior correspondência de semelhança e metadados relacionados disponíveis na biblioteca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig03.jpg"> Figura 3: Realinhamento de modelos. Fluxo de trabalho ilustrando as etapas que permitem o realinhamento do modelo por transformação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig04.jpg"> Figura 4: Interface GC Investigador. Painel de pesquisadores com todas as imagens selecionadas rotuladas de acordo com a região de produção do óleo (esquerda) e a lista de picos confiáveis/volumes de bolhas em cada amostra (à direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig05.jpg"> Figura 5: Modelo direcionado e UT. (A) Picos confiáveis resultantes do processamento automatizado na etapa 11; círculos vermelhos correspondem a analitos conhecidos, enquanto círculos verdes são desconhecidos. No painel sobreposto, as propriedades do objeto de modelo são mostradas para o (Z)-3-hexenal. (B) Área ampliada que mostra os picos UT (círculos vermelhos e verdes) e regiões-de-pico (gráficos vermelhos) do modelo UT combinada com um óleo amostral adquirido a 70 eV energia de ionização. (C) Modelo UT combinado com um óleo amostral adquirido a 12 eV energia de ionização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61529/61529fig06.jpg"> Figura 6: Parcelas de carregamento pca. Eles mostram a conformação natural das amostras (óleos da Toscana e da Sicília) como resultam em (A) distribuição de picos direcionados ou (B) distribuição de picos UT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/61529fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivos Suplementares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61529/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar esses arquivos.</a>

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Chromatographic Fingerprinting by Template Matching for Data Collected by Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography

Este protocolo apresenta uma abordagem para impressão digital e explorar dados multidimensionais coletados por cromatografia abrangente de gás bidimensional acoplado à espectrometria de massa. Algoritmos dedicados de reconhecimento de padrões (correspondência de modelos) são aplicados para explorar as informações químicas criptografadas na fração volátil de azeite extravirgem (ou seja, volatilome).

Impressão digital cromatográfica por correspondência de modelo para dados coletados por cromatografia abrangente de gás bidimensional

Data processing and evaluation are critical steps of comprehensive two-dimensional gas chromatography (GCxGC), particularly when coupled to mass ...

chromatographic-fingerprinting-template-matching-for-data-collected

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.7K visualizações.  Università degli Studi di Torino. Este protocolo apresenta uma abordagem para impressão digital e explorar dados multidimensionais coletados por cromatografia abrangente de gás bidimensional acoplado à espectrometria de massa. Algoritmos dedicados de reconhecimento de padrões (correspondência de modelos) são aplicados para explorar as informações químicas criptografadas na fração volátil de azeite extravirgem (ou seja, volatilome).

Vídeo: Chromatographic Fingerprinting by Template Matching for Data Collected by Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography

Fabricating Nanogaps by Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two electrodes-and generating them in practical quantities-is still challenging. The preparation of nanogap electrodes using nanoskiving, which is a form of edge lithography, is a fast, simple and powerful technique. This method is an entirely mechanical process which does not include any photo- or electron-beam lithographic steps and does not require any special equipment or infrastructure such as clean rooms. Nanoskiving is used to fabricate electrically addressable nanogaps with control over all three dimensions; the smallest dimension of these structures is defined by the thickness of the sacrificial layer (Al or Ag) or self-assembled monolayers. These wires can be manually positioned by transporting them on drops of water and are directly electrically-addressable; no further lithography is required to connect them to an electrometer.

The fabrication of electrically addressable, high-aspect-ratio (> 1000:1) metal nanowires separated by gaps of single nanometers using either sacrificial layers of aluminum and silver or self-assembled monolayers as templates is described. These nanogap structures are fabricated without a clean room or any photo- or electron-beam lithographic processes by a form of edge lithography known as nanoskiving.

Confecção Nanogaps por Nanoskiving

There are several methods of fabricating nanogaps with controlled spacings, but the precise control over the sub-nanometer spacing between two ...

Química

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Exploring the Radical Nature of a Carbon Surface by Electron Paramagnetic Resonance and a Calibrated Gas Flow

While the first Electron Paramagnetic Resonance (EPR) studies regarding the effects of oxidation on the structure and stability of carbon radicals date back to the early 1980s the focus of these early papers primarily characterized the changes to the structures under extremely harsh conditions (pH or temperature)1-3. It is also known that paramagnetic molecular oxygen undergoes a Heisenberg spin exchange interaction with stable radicals that extremely broadens the EPR signal4-6. Recently, we reported interesting results where this interaction of molecular oxygen with a certain part of the existing stable radical structure can be reversibly affected simply by flowing a diamagnetic gas through the carbon samples at STP7. As flows of He, CO2, and N2 had a similar effect these interactions occur at the surface area of the macropore system.
This manuscript highlights the experimental techniques, work-up, and analysis towards affecting the existing stable radical nature in the carbon structures. It is hoped that it will help towards further development and understanding of these interactions in the community at large.

Stable radicals that are present in carbon substrates interact with paramagnetic oxygen through a Heisenberg spin exchange. This interaction can be significantly reduced under STP conditions by flowing a diamagnetic gas over the carbon system. This manuscript describes a simple method to characterize the nature of those radicals.

Explorando a Natureza Radical de uma superfície de carbono por ressonância paramagnética eletrônica e um fluxo de gás Calibrado

While the first Electron Paramagnetic Resonance (EPR) studies regarding the effects of oxidation on the structure and stability of carbon radicals date ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Quantitative Detection of Trace Explosive Vapors by Programmed Temperature Desorption Gas Chromatography-Electron Capture Detector

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive vapor samples. The direct liquid deposition method yields a higher fidelity between the analysis of vapor samples and the analysis of solution standards than using separate injection methods for vapors and solutions, i.e., samples collected on vapor collection tubes and standards prepared in solution vials. Additionally, the method can account for instrumentation losses, which makes it ideal for minimizing variability and quantitative trace chemical detection. Gas chromatography with an electron capture detector is an instrumentation configuration sensitive to nitro-energetics, such as TNT and RDX, due to their relatively high electron affinity. However, vapor quantitation of these compounds is difficult without viable vapor standards. Thus, we eliminate the requirement for vapor standards by combining the sensitivity of the instrumentation with a direct liquid deposition protocol to analyze trace explosive vapor samples.

Trace explosive vapors of TNT and RDX collected on sorbent-filled thermal desorption tubes were analyzed using a programmed temperature desorption system coupled to GC with an electron capture detector. The instrumental analysis is combined with direct liquid deposition method to reduce sample variability and account for instrumentation drift and losses.

Detecção quantitativa de rastreamento vapores explosivos por temperatura programada Desorption Gas Chromatography-Electron Captura Detector

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

A auto-montagem de formas bidimensionais complexos de ADN de cadeia simples Azulejos

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spectrometer in conjunction with Multivariate Data Analysis (MVDA). 3D7 P. falciparum were cultured to 10% parasitemia ring stage parasites and used to spike fresh donor isolated RBCs to create a dilution series between 0&#8211;1%. 10 &#181;L of each sample were placed onto the center of the ATR diamond window to acquire the spectrum. The sample data was treated to improve the signal to noise ratio and to remove the contribution of water, and then the second derivative was applied to resolve spectral features. The data were then analyzed using two types of MVDA: first Principal Component Analysis (PCA) to determine any outliers and then Partial Least Squares Regression (PLS-R) to build the quantification model.

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Here, we present a protocol for the detection and quantification of Plasmodium falciparum in infected aqueous red blood cells using an attenuated total reflection infrared spectrometer and multivariate data analysis.

Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

Exfoliation and Analysis of Large-area, Air-Sensitive Two-Dimensional Materials

We describe methods for producing and analyzing large, thin flakes of air-sensitive two-dimensional materials. Thin flakes of layered or van der Waals crystals are produced using mechanical exfoliation, in which layers are peeled off a bulk crystal using adhesive tape. This method produces high-quality flakes, but they are often small and can be hard to find, particularly for materials with relatively high cleavage energies such as black phosphorus. By heating the substrate and the tape, two-dimensional material adhesion to the substrate is promoted, and the flake yield can be increased by up to a factor of ten. After exfoliation, it is necessary to image or otherwise analyze these flakes but some two-dimensional materials are sensitive to oxygen or water and will degrade when exposed air. We have designed and tested a hermetic transfer cell to temporarily maintain the inert environment of a glovebox so that air-sensitive flakes can be imaged and analyzed with minimal degradation. The compact design of the transfer cell is such that optical analysis of sensitive materials can be performed outside of a glovebox without specialized equipment or modifications to existing equipment.

A method for exfoliating large thin flakes of air sensitive two-dimensional materials and safely transporting them for analysis outside of a glovebox is presented.

Esfoliação e análise da grande-área, bidimensionais materiais sensíveis ao ar

We describe methods for producing and analyzing large, thin flakes of air-sensitive two-dimensional materials. Thin flakes of layered or van der Waals ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

Um método de cromatografia de gás de Pyrolysis de duas etapas com detecção espectrométrica de massa para identificação de ingredientes de tinta de tatuagem e produtos falsificados

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...