Este protocolo inclui uma nova estratégia química para anexar peptídeos terapêuticos a superfícies metálicas, e tem o potencial de melhorar a biocompatibilidade de uma ampla gama de biomateriais metálicos. Esta é uma técnica universal e robusta para anexar peptídeos e proteínas terapêuticas às superfícies metálicas nuas de bioimplants. Usamos essa tecnologia para melhorar a biocompatibilidade dos stents metálicos, anexando peptídeos CD47, a fim de evitar as respostas inflamatórias que são desencadeadas pelo stent.
Comece lavando os cupons de papel alumínio de aço inoxidável ou discos de malha com 2 isopropanol em um agitador por cinco minutos. Faça esta lavagem duas vezes e depois lave as amostras duas vezes com clorofórmio por 10 minutos por lavagem. Coloque as amostras de aço inoxidável limpas em um forno a 220 graus Celsius por 30 minutos.
Mergulhe as folhas assadas ou discos de malha em uma solução aquosa de PABT e incuba-as em um shaker por uma hora. Lave as amostras modificadas pelo PABT com água destilada desionizada cinco vezes. Transfira os espécimes para um novo frasco e repita as lavagens.
Trate as amostras com TCEP por 15 minutos em temperatura ambiente em um agitador. Degas desionizou água destilada em um frasco fundo redondo com um dispositivo gerador de vácuo, como um liofilizador, e lavar as folhas ou discos de malha com a água desgassada cinco vezes. Transfira as amostras para um novo frasco e repita as lavagens.
Prepare cinco mililitros de solução PEI-PDT de 1%, diluindo 212,5 microliters do estoque PEI-PDT e 125 microliters de 0,4 acetato de sódio molar na água desgaseada. Incubar as amostras de aço inoxidável lavadas com 1%PEI-PDT. Substitua o ar por gás argônio, sele os frascos herméticos e misture-os em um agitador por uma hora.
Prossiga imediatamente com a conjugação do peptídeo ou armazene as amostras a quatro graus Celsius por até uma semana. Prepare um miligrama por mililitro solução de estoque cd47 de peptídeo humano dissolvendo o peptídeo humano CD47 em pó em ácido desgassed 50% acético, em seguida, prepare a solução de trabalho dissolvendo 500 microliters do estoque em 4,5 mililitros de PBS degassed. Incubar as amostras revestidas pei-PDT lavadas com a solução de trabalho do peptídeo CD47 à temperatura ambiente com agitação por uma hora.
Quando terminar, lave as amostras revestidas de peptídeos CD47, conforme descrito no manuscrito do texto. Depois de revestir as folhas metálicas com peptídeo CD47 ou peptídeo mexido, corte tubos de PVC de 45 cm em três peças de 38 centímetros de comprimento e insira até oito peptídeos não modificados, ou peptídeos CD47 modificados em três tubos diferentes. Coletar 30 mililitros de sangue de doadores humanos saudáveis livres de quaisquer medicamentos anti-plaquetas, pré-carregar a seringa com um mililitro de 4% de citrato de sódio para evitar a coagulação do sangue coletado.
Coloque 10 mililitros de sangue em cada tubo usando uma seringa de 10 mililitros e conecte as extremidades com adaptadores metálicos. Coloque os tubos cheios de sangue sobre as rodas do aparelho de loop Chandler e passe o sangue ao longo das folhas metálicas por rotação de roda a 37 graus Celsius por quatro horas. Escorra o sangue dos tubos e descarte-o de acordo com os requisitos do IRB, em seguida, corte os tubos com um bisturi para recuperar as folhas.
Prepare 2% solução de glutaraldeído diluindo a solução de 70% no tampão de cacodilato de sódio com cloreto de sódio molar de 0,1. Incubar as folhas na solução de 2%glutaraldeído por 15 minutos e armazená-las a quatro graus Celsius durante a noite. Antes de analisar as folhas metálicas, lave-as três vezes com PBS.
Aqueça oito mililitros de PBS em um banho de água de 37 graus Celsius. Prepare a solução de estoque de corante CFDA de 10 milimoslar adicionando 90 microliters de DMSO a um frasco CFDA e, em seguida, prepare a solução de trabalho adicionando 75 microliters do estoque CFDA ao PBS quente. Inverta o tubo algumas vezes para misturar e cobri-lo com papel alumínio.
Coloque cada folha em um mililitro de corante CFDA em uma placa de 24 poços. Cubra a placa com papel alumínio e incuba a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos, depois lave as folhas três vezes em PBS e exploda-as com um microscópio de fluorescência. A concentração do peptídeo conjugado TAMRA CD47 foi quantificada para determinar a densidade máxima de imobilização do peptídeo na superfície metálica.
A retenção máxima de peptídeos foi de aproximadamente 180 nanogramas por centímetro quadrado, o que foi alcançado com uma concentração de entrada de 100 microgramas por mililitro. A imobilização do peptídeo conjugado TAMRA CD47 nas superfícies metálicas modificadas foi corroborada ainda mais pela microscopia de fluorescência, que mostrou uma fluorescência uniforme emitida da superfície dos discos de malha conjugados CD47 conjugados da TAMRA. Apenas fluorescência mínima foi detectada na superfície das malhas de controle que não tinham a modificação, excluindo assim um PEPTídeo conjugado TAMRA não especificamente ligado CD47 como a principal fonte de fluorescência.
Também foi confirmado que as superfícies revestidas de peptídeos CD47 mostram uma redução drástica no apego celular transportado pelo sangue em comparação com os controles de peptídeos modificados e não modificados. Monócitos isolados das células de casaco de rato foram cultivados em papel alumínio nu e peptídeos CD47-modified steel folhas. Observou-se atenuação de 58% do apego agudo de monócitos, sua conversão a macrófagos e proliferação de macrófagos nas superfícies funcionalizadas.
Ao tentar este protocolo, é muito importante realizar as etapas envolvendo água desgaseada ou reagentes a serem realizadas o mais rápido possível e minimizar a exposição ao oxigênio. Nossa tecnologia modula seletivamente a interação celular com superfícies metálicas e um ensaio típico de identificação do tipo celular, como RT-PCR, citometria de fluxo e imunofluorescência, são compatíveis com essa técnica. Quando desenvolvida para uma gama de peptídeos bioativos, essa tecnologia pode ser fundamental para aumentar a biocompatibilidade na interface do material tecidual.
