Autores gostariam de agradecer ao Dr. Andre Walder e Nicolas Perrin para a fabricação de implantes de titânio, K. Benmlih para o acúmulo dos moldes de teflon e Dr. G. Prevost por sua ajuda com experiências com animais. Reconhecemos também a Região Alsácia e PMNA (Pólo Materiaux et Nanociências d&#39;Alsace) para a contribuição financeira.

1. Preparação de gradientes de microporos em implantes metálicos macroporosas <ol><li> Limpar os implantes (por exemplo, implantes feitos de esferas de titânio de grau médico, com uma gama de tamanhos de 400-500 mM, Neyco SAS, França) com etanol e acetona, em seguida, sonicar durante 15 min. </li><li> Concepção e fabrico de moldes de Teflon de acordo com o tamanho e forma do implante (Para as experiências de padrão, são usados ​​moldes cilíndricos de 1,5 cm de diâmetro, com uma altura de 2 cm). Os moldes devem ser modular, de modo que as determinadas partes podem ser removidos durante a extracção. Um tal desenho de molde assegura que o controlo sobre o processo de extracção, forçando o movimento do fluido de extracção de uma maneira dirigida. </li><li> Para implantes tubulares destinados a substituir a traqueia, a estrutura deve ser composto de três partes: i) uma parte do fundo para determinar o tamanho do implante, ii) um mandril e iii) um núcleo exterior que é removível. Desta forma, o gradiente de tamanho de poro pode ser formado a partir do exterior para dentro. </li> &lt;li&gt; Preparar a solução de polímero sintético (PLLA): Para a solução de PLLA congelamento / extracção deve ser preparado de uma mistura binária de dioxano e água (87:13%, v: v). </li><li> Aquecer a mistura a 60 ° C, a fim de se obter uma solução homogénea. 60 ° C, que é escolhido como o limite superior da resistência à temperatura para as seringas de vidro de precisão que tem de ser utilizado para a introdução da solução para os implantes. </li><li> Se forem utilizados alta concentração (≥ 6%), soluções de PLLA de elevado peso molecular, introduzir a solução no implante imediatamente após o aquecimento. Caso contrário, a gelificação da solução ocorre sem imersão completa. </li><li> Calcular o volume da solução de polímero necessária no que diz respeito à porosidade do implante, para alterar a precisão do volume da solução congelada pode ser levado em conta. </li><li> Introduzir a solução para os implantes com seringas de vidro de precisão com precisão de 0,1 ul. O limite inferior para a concentração de polímero é3% para a formação de poros gradiente reprodutível enquanto se torna difícil obter uma distribuição homogénea das amostras de espessura acima de 6%. No entanto, para aplicações específicas, podem ser usadas outras concentrações. </li><li> Congele as amostras directamente a -80 ° C ou com um período de incubação prévia de 30 min à temperatura ambiente. Condições de congelação parcialmente determinar a formação de poros, pelo que as condições de congelamento pode ser ajustada de acordo com a porosidade destinada. Manter as amostras durante a noite a -80 ° C. </li><li> Extração: Mergulhe os implantes em 80% EtOH pré-refrigerados. Efectua-se a extracção à temperatura de -20 ° C durante a noite. Para se obter gradientes porosidade, remover todas as partes do molde excepto o mandril para os implantes tubulares e todas as partes, com excepção da parte do fundo para implantes em forma de disco. É um bisturi pré-refrigerada para facilitar a separação do molde. </li><li> Após extracção, a -20 ° C durante a noite 19, remover as restantes partes do molde e ar seco dos implantes. Para a caracterização dea porosidade geral da análise da estrutura de porosímetro de mercúrio é necessário. Mercury medições porosímetro mostrou picos distintos que correspondem aos poros em ambos os lados do implante e os poros mais pequenos interdispersas. Contudo, os dados mais importantes é a diferença entre as porosidades das superfícies intraluminais e extraluminal, que podem ser analisadas por Image J para a distribuição de tamanho de poro com um microscópio electrónico de varredura (SEM) 20. Para a verificação do gradiente de poros, congelar-fraturar as amostras e observar a seção transversal com SEM. </li><li> Devido à natureza porosa aberta dos implantes utilizados, e a capacidade de reflectir a luz de titânio, é possível fazê-z-as pilhas de células marcadas dentro de implantes porosos. Rotular as células com PKH26 ou Calcein-AM e visualizar os implantes com a microscopia confocal a laser. </li></ol> 2. Revestimento de superfície de implantes metálicos porosos com Colágeno / alginato Multilayers <ol><li> Para construir-upde multicamadas, a mais alta reprodutibilidade é obtido com robôs de mergulho. No entanto, se um robô de imersão não está disponível estas etapas podem ser feitas manualmente. </li><li> Use um grau de colágeno tipo I médica e alginato de sódio. As concentrações são optimizados de 0,5 g / L para cada em 150 mM de NaCl em tampão de citrato a pH 3,8. </li><li> Dissolve-se a solução de colagénio durante a noite para assegurar a homogeneidade da solução. PH ácido de 3,8 é necessária para a acumulação estável das camadas que a estrutura é instável antes da reticulação, em pH neutro. </li><li> Depositar as camadas por um sistema de robô mergulhando por imersão dos implantes em soluções de colágeno e alginato como alternativa. Deposição de tempo é de 15 minutos para cada camada subsequente. Lavar a estrutura entre os passos de deposição com NaCl 150 mM a pH 3,8, durante 5 minutos. </li><li> Projeto titular específico para a utilização de implantes com robôs de imersão usados ​​na produção de camadas múltiplas polielectrólito. Depositar as camadas da superfície de titânio ou apenas implants ou implantes modificados, conforme descrito na seção 1. </li><li> A estabilização da membrana basal mimetizar com genipin: Preparar a solução de reticulação numa dimetilsulfóxido (DMSO) / tampão de citrato (150 mM de NaCl, pH 3,8) a 01:04 v: v proporção. Uma ampla gama de concentrações e pode ser usada a 100 mM é adequado para a reticulação. Dissolver genipin primeiro no componente de DMSO e adiciona o componente de água mais tarde para evitar a aglomeração. </li><li> CROSSLINK as amostras pela imersão na solução de reticulação entre 12-24 horas. Depois enxágüe com copiosa quantidade de tampão citrato (pH 3,8). </li><li> Após as etapas de lavagem, esterilizar as amostras, quer com tratamento UV (30 min) ou num banho de antibiótico / antifúngico (Penicilina / Estreptomicina, Fungizone). </li><li> Os parâmetros principais que determinam a qualidade da membrana basal são imitar a sua espessura e o diâmetro das fibras. Calcule o diâmetro da fibra, utilizando imagens de microscopia de força atômica (AFM) obtidas no modo de contato. Secam-se as amostras com umfluxo de nitrogênio antes da imagem. Quantificar a espessura de pelo menos 10 fibras por imagem para determinar a espessura média de fibrilas com software Image J. </li><li> A espessura dos filmes pode ser determinada por testes de arranhão utilizando AFM. Dry (COL / ALG) 24 filmes multicamadas / Col. Use uma agulha de seringa para arranhar o filme. Depois da localização da raiz com um microscópio de luz, com a obtenção de imagens AFM em 10 x 10 um 2 superfícies no limite do zero. Calcular as alturas a partir dos perfis obtidos com o software de AFM, que fornece a espessura da camada de película. </li></ol> 3. Monitoramento indireto da Integração Implant In vivo pela análise do plasma sanguíneo <ol><li> Todas as aprovações das comissões necessárias devem ser tomadas para a experimentação animal de acordo com as regras de cada país 21. No nosso caso, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Research Council, 2010) é seguido e thaprovação e da Universidade de Estrasburgo comitê de ética é obtido. </li><li> Realizar a implantação no local de destino. O protocolo de monitoramento sangue dado aqui foi usado para substituição traqueal em coelhos Nova Zelândia Branco de uma ressecção traqueal 15 mm. </li><li> Após a implantação é um acompanhamento diário necessárias, tais como montioring o bem-estar dos animais (cura em torno dos locais cirúrgicos, taxa de respiração) em geral e gravação de seu peso. </li><li> Para validar o exame de sangue, usar um método bem estabelecido, como testes de ELISA para níveis de PCR no sangue. Testes de PCR para muitos animais estão disponíveis e o ensaio específico utilizado para coelhos está listado na Tabela 1. Da mesma forma, usar western blotting para a determinação dos níveis CGA. Anticorpos anti-CGA monoclonais (anti-CGA 47-68) foram utilizados neste protocolo. </li><li> Para a caracterização de plasma, a obtenção de amostras de sangue das veias auriculares dos coelhos. Centrifugar a 5000 rpm durante 20 min a 4 °; C. Utilize-se o sobrenadante obtido para análise. Em nosso processo, estes testes são feitos em uma base semanal, mas testes mais freqüentes também são possíveis. </li><li> HPLC de fase reversa de purificação das proteínas do plasma: Extrai-se a plasma de coelho com 0,1% de ácido trifluoroacético (1:1, v: v). Purifica-se o extracto por meio de um sistema de HPLC Dionex (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA EUA) num nucleosil de fase inversa 300-5C18-coluna (4 x 250 mm, tamanho de partícula 5 fim; porosidade, 300 Â). </li><li> Ler a absorvância a 214 e 280 nm. O sistema de solvente usado é i) Solvente A: 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água e ii) Solvente B: 0,09% (v / v) de ATF em 70% (v / v) de acetonitrilo-água. </li><li> É um caudal de 700 ul / min usando gradientes de eluições. Recolha as frações de pico. Concentre-se as fracções por evaporação por aplicação de vácuo de velocidade. É importante para parar o vácuo de velocidade antes secura completa. </li><li> Correlacionar os picos obtidos em diferentes pontos de tempo ao longo do coURSE do período de implantação. Usar os péptidos purificados que estão mostrando as tendências consistentes durante o curso de implantação para a identificação automática por sequenciação de Edman. </li><li> Sequenciação automática de Edman dos péptidos: Determinar a sequência N-terminal dos péptidos purificados por degradação automática de Edman usando um microsequencer Procise. Carregar a amostra a filtros de fibra de vidro tratados com polibreno. O passo seguinte é a identificação de ácidos aminados feniltiohidantoína (PTH-Xaa) por cromatografia sobre uma coluna C 18 (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Depois de a sequência obtida, ela pode ser identificada pelo software de banco de dados SWISS explosão utilizando-Prot. </li></ol>

<ol>
	<li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).</li><li>Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+methods+of+porous+metals+for+use+in+orthopaedic+applications.">Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications.</a> Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).</li><li>Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+tracheal+prostheses+made+of+porous+titanium:+a+study+on+sheep.">Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).</li><li>Janssen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngotracheal+reconstruction+with+porous+titanium+in+rabbits:+are+vascular+carriers+and+mucosal+grafts+really+necessary.">Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).</li><li>Li, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+ingrowth+in+porous+titanium+implants+produced+by+3D+fiber+deposition.">Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition.</a> Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).</li><li>Schultz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyelectrolyte+multilayers+functionalized+by+a+synthetic+analogue+of+an+anti-inflammatory+peptide,+alpha-MSH,+for+coating+a+tracheal+prosthesis.">Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis.</a> Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Functionalized+Polyelectrolyte+Multilayers+as+Proangiogenic+Prosthetic+Coatings.">VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings.</a> Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).</li><li>Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Geometric+Challenges+on+Cell+Migration.">Effect of Geometric Challenges on Cell Migration.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).</li><li>O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pore+size+on+cell+adhesion+in+collagen-GAG+scaffolds.">The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds.</a> Biomaterials. 26, 433-441 (2005).</li><li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis.">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).</li><li>Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+poly(L-lactide)+(PLLA)+scaffolds+for+tissue+engineering+using+liquid+-+liquid+phase+separation+and+freeze+extraction.">Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow.">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip.">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li><li>Chaubaroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-Based+Fibrillar+Multilayer+Films+Cross-Linked+by+a+Natural+Agent.">Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent.</a> Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).</li><li>Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+spatial+architecture+on+cellular+colonization.">Effect of spatial architecture on cellular colonization.</a> Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).</li><li>Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+systems+for+vascularization+-+Learning+from+nature.">Co-culture systems for vascularization - Learning from nature.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).</li><li>Lavalle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Aspects+of+Films+Prepared+by+a+Sequential+Deposition+of+Species:+Perspectives+for+Smart+and+Responsive+Materials.">Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials.</a> Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+chromogranin+A+at+admission:+An+early+biomarker+of+severity+in+critically+ill+patients.">Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients.</a> Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).</li><li>Goh, Y., Ooi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+porous+poly(l+-lactide)+scaffolds+using+solid+-+liquid+phase+separation.">Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).</li><li>Vrana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+macroporous+titanium+tracheal+implants+with+biodegradable+structures:+Tracking+in+vivo+integration+for+determination+of+optimal+in+situ+epithelialization+conditions.">Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).</li><li>Dupret-Bories, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+protocol+for+implantation+of+tracheal+prostheses+in+sheep.">Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).</li><li>Gasnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+post-translational+modifications+on+chromogranin+B+from+bovine+adrenal+medullary+chromaffin+granules.">Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules.</a> Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).</li><li>Vrana, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Titanium/Biodegradable+Polymer+Implants+with+an+Hierarchical+Pore+Structure+as+a+Means+to+Control+Selective+Cell+Movement.">Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement.</a> PLoS ONE. 6, e20480 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Fibrin+Gel+Bead+Assay+for+the+Study+of+Angiogenesis.">Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cells+and+Their+Use+in+the+Study+of+Neutrophil+Transmigration+Under+Flow+Conditions.">Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).</li><li>Dong, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomediated+crosslinking+of+C6-cinnamate+derivatized+type+I+collagen.">Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen.</a> Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).</li></ol>

NE Vrana é um funcionário da Protip SAS.

Gradientes de poros são ferramentas importantes na engenharia de tecidos de interface e o sistema aqui descrito pode ser utilizado sozinho ou em conjunto com implantes metálicos para formar gradiente de poro para estudar a migração celular. O sistema não necessita de qualquer configuração extra ou equipamento adicional, excepto uma coifa química para lidar com solventes orgânicos, pelo que pode ser aplicada em laboratórios de biologia. Polímeros similares, tais como poli (ácido glicólico) (PGA), poli (ácid...

Actualmente os implantes metálicos disponíveis são adequados para aplicações de suporte de carga, mas a sua degradabilidade não necessita de modelos que garantam uma interface forte com o tecido em torno deles 1. Ao proporcionar estruturas que facilitam o crescimento celular em colonização e in vivo, o tempo de vida dos implantes metálicos podem ser prolongadas 2. Os implantes metálicos abertamente porosa são materiais promissores para a engenharia de tecidos da interface e também para assegurar uma boa colonização dos implantes. Eles têm sido utilizados como implantes ortopédicos activamente e também como implantes traqueais 3-5. No entanto, ainda há problemas que precisam de ser resolvidos, tais como o controlo preciso sobre o movimento celular nas áreas dos poros. A falha para controlar este processo pode conduzir à colonização incompleto em uma extremidade e restenose na outra. Também ainda a funcionalização destes implantes é necessária para a obtenção de elevados funções tais como, entrega de factores de crescimento,vascularização dirigido e movimento simultâneo de diferentes tipos de células de 6-8. Para implantes traqueais, isto é crucial que a colonização do implante por um tecido vascularizado é desejável. No entanto, o tecido em crescimento descontrolado para o lúmen de traqueia é indesejável porque ele diminui a permeabilidade do implante. Uma possibilidade para controlar o movimento da pilha é de exclusão de tamanho. Conhecendo o tamanho das células alvo e da sua capacidade para interagir com um dado polímero sintético é possível desenvolver gradientes de poros que pode eficazmente determinam a profundidade de célula de circulação. Por exemplo através da criação de uma arquitectura de poro que seja suficientemente grande para a entrada das células do tecido conjuntivo tais como os fibroblastos extraluminally, mas suficientemente pequenos (menos de 10 mm) para impedir o seu movimento intraluminarmente um controlo efectivo sobre a colonização de um implante tubular pode ser alcançado. De métodos de criação de poros disponíveis, tais como congelamento drying, a lixiviação das partículas, gás de formação de espuma 9,10; mais fácil de adaptar o método para a rápida formação de gradientes de poro com uma quantidade mínima de equipamentos necessários por congelação é de extracção 11. Neste método, uma solução de polímero é congelado numa mistura binária de um solvente orgânico e água. Em seguida, o solvente é trocado por meio de extracção por um líquido, pré-refrigerada miscível tal como etanol. Congelamento e condições de extracção determinar a forma e tamanho dos poros e, se a extracção é realizada de uma maneira em que o movimento da solução de extracção, pode ser controlada, a forma e tamanho de poro pode ser modulada direcionalmente. Segundo passo para tecidos multicelulares é a formação de barreiras porosas entre diferentes tipos de células para controlar a sua interacção. Isto também é necessário para a disponibilidade de diferentes microambientes para diferentes tipos de células em função das suas exigências de 12,13. Traquéia é um órgão tubular que liga laringe com brônquiosi. Tem um revestimento interior do epitélio ciliar pseudo com células caliciformes produtoras de muco que interdispersas. A estrutura 3D e estabilidade da traqueia é mantida por cartilagem em forma de C-rings. Assim, numa traqueia artificial deveria haver uma junção definida entre o tecido conectivo e a camada epitelial ciliar. Embora uma estrutura em 3D é necessário que a parte do tecido conjuntivo, a migração de células epiteliais requer uma membrana basal, como de superfície para obter o movimento direccional e fechamento da ferida. Polieletrólito filmes multicamadas (PEM) são uma opção possível obter imita membrana basal. Método camada por camada (LBL) é um processo versátil de obter revestimentos de superfície fina e funcional. É baseado em interações eletrostáticas de dois polieletrólitos de cargas opostas e seu acúmulo de forma seqüencial para obter revestimentos de superfície em nanoescala cujas propriedades podem ser alteradas simplesmente mudando variáveis ​​como espécie de polieletrólito, pH,Número camada, a adição de uma camada de nivelamento, a reticulação, etc Uma das principais vantagens do método de automontagem é a sua capacidade para conformar à topografia do substrato subjacente. Assim, sob condições controladas, este método pode também ser utilizado para a obtenção de uma cobertura de superfície de estruturas porosas. Se colagénio é utilizado como um dos polielectrólitos é possível obter estruturas nanofibrillar que podem mimetizar a superfície da membrana basal. A hidrofobicidade do titânio permite o desenvolvimento de tais estruturas e fibrillarity pode ser preservada em revestimentos grossos 14. Esta forma de fixação e movimento de células na superfície também pode ser controlado. Usando extracção por congelação e revestimento de filme LbL sequencialmente, uma estrutura em que o movimento da pilha pode ser controlada lateralmente, longitudinalmente e pode ser obtida perifericamente 15. Aqui nós descrevemos dois métodos de modificação novas para implantes de titânio usando seu comportamento hidrofóbico que pode seralargado a alteração de vários implantes porosos: i) a formação de gradientes de microporos dentro dos implantes de titânio macroporosos com hidrófobos, polímeros sintéticos ii) a formação de uma camada de espessura de película de polímero sobre a superfície do implante que suporta o crescimento de células e formação de revestimento de multicamadas de polielectrólitos. Estes métodos podem ser usados ​​sequencialmente ou separadamente. Eles proporcionam estruturas que garantem a migração controlada e organização espacial dos diferentes tipos de células em tecidos multicelulares 16,17. Para o caso específico de traqueia, o resultado pretendido para o implante seria a colonização por tecido fibrovascular dentro dos gradientes micropore sem reestenose e da formação do revestimento interior de células epiteliais ciliadas sobre as multicamadas polielectrólitos. Uma maneira de controlar a integração dos implantes é fazer pequenas intervenções cirúrgicas durante o período de sua integração com o hospedeiro in situ. A fim de ser capaz tó decidir sobre o momento das intervenções, é importante ter informações sobre os efeitos sistêmicos do implante. Proteína C-reativa (PCR) tem sido utilizada para o monitoramento da infecção e resposta inflamatória em ambientes clínicos. Cromogranina A (CGA) também pode ser usado de uma maneira semelhante e podem proporcionar resultados mais precisos para observar o nível de inflamação 18. Como uma forma possível de se observar a integração do implante metálico in vivo, apresentamos um processo de acompanhamento contínuo dos efeitos sistêmicos do implante por caracterização de amostras de sangue de animais com Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) e posterior sequenciamento de proteínas. Elaboração do presente método pode ser usado para evitar a análise histológica de ponto final regular. Corte histológico de implantes metálicos é um processo demorado, caro e complicado e só pode ser realizado em pontos de tempo específicos. Por essa razão, bem concebido testes sanguíneos que fornecem informações robustas sobre a saúde implante seriaser possíveis rotas para diminuir experiências com animais, como manda as regras da UE recentes sobre experimentos com animais. Os métodos aqui apresentados podem ser utilizados para melhorar o desempenho de implantes metálicos por meio de funcionalização ou ter uma forma alternativa de controlo dos implantes existentes.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dioxane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>360481</td>
 <td>Toxic material, Strictly under chemical hood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLLA 
 i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g 
 ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g 
 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>94829, 81273</td>
 <td>The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)</td>
 <td>Novamatrix</td>
 <td>4200006</td>
 <td>Low viscosity(20-200 mPa.s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen type I (Bovine)</td>
 <td>Symatese</td>
 <td>CBPE2US100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen/Strep, Fungizone </td>
 <td>Promocell</td>
 <td>C42020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genipin</td>
 <td>Wako</td>
 <td>0703021</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. </td>
 <td>Bruker </td>
 <td>MSCT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trifluoroacetic acid for HPLC ,&ge;99.0% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>302031</td>
 <td>Hazardous Material, Please follow MSDS carefully</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetonitrile, for HPLC ,&ge;99.9% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34998</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcein-AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C3100MP </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>PKH26GL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit</td>
 <td>Genway Bio</td>
 <td>GWB-9BF960 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO, Bioreagent, &ge;99.7% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope</td>
 <td>Bruker</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Procise microsequencer </td>
 <td>Applied Biosystems </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultima 3000 HPLC system </td>
 <td>Dionex</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100</td>
 <td>Hitachi </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 </td>
 <td>Zeiss </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 1. List of Materials and Reagents.

multi-scale modification of metallic implants with pore gradients, polyelectrolytes and their indirect monitoring in vivo

Os implantes metálicos, especialmente os implantes de titânio, são amplamente utilizados em aplicações clínicas. Tecido em crescimento e integração para estes implantes nos tecidos são parâmetros importantes para os resultados clínicos de sucesso. A fim de melhorar a integração do tecido, implantes metálicos porosos têm sido desenvolvidos. A porosidade aberta de espumas metálicas é muito vantajoso, uma vez que as áreas dos poros pode ser funcionalizado, sem comprometer as propriedades mecânicas de toda a estrutura. Aqui descrevemos tais modificações usando implantes de titânio poroso baseado em microesferas de titânio. Usando propriedades físicas inerentes, tais como a hidrofobicidade de titânio, é possível obter gradientes de poros hidrofóbicos dentro microbead implantes metálicos baseados e, ao mesmo tempo que têm uma membrana basal mímico à base de polímeros hidrofílicos, naturais. Gradientes de poro 3D são formadas por polímeros sintéticos tais como o ácido poli-L-láctico (PLLA) pelo método de congelação-extracção. 2D nanofibrillar suras faces são formadas usando colagénio / alginato seguido por um passo de reticulação com um agente de reticulação natural (genipin). Este filme nanofibrillar foi construído por camada pelo método de deposição das duas moléculas de carga oposta, o colagénio e alginato camada (LBL). Finalmente, um implante onde diferentes áreas pode acomodar diferentes tipos de células, como isto é necessário para muitos tecidos multicelulares, podem ser obtidos. Por, esta forma movimento celular em diferentes direcções de diferentes tipos de células pode ser controlada. Tal sistema é descrito para o caso específico de traqueia de regeneração, mas pode ser modificado para outros órgãos alvo. Análise da migração celular e os métodos possíveis para a criação de diferentes gradientes de poros são elaborados. O passo seguinte na análise de tais implantes é a sua caracterização após a implantação. No entanto, a análise histológica de implantes metálicos é um processo longo e complicado, portanto, para monitoramento de reação host para implantes metálicos in vivo a umaMétodo lternative baseada no controlo de proteínas do sangue e CGA diferente é também descrito. Estes métodos podem ser utilizados para o desenvolvimento in vitro de migração e feitos por testes de colonização e também ser usado para a análise dos implantes metálicos funcionalizados in vivo sem histologia.

A formação de gradientes de poro Ao alterar a concentração da solução de PLLA, é possível controlar o tamanho dos poros no lado extraluminal dos implantes. A forma e tamanho dos poros foi significativamente afectada pela presença de implantes de titânio (Figuras 1a e 1b). Tamanhos de poros variando 40-100 mM e utilização de concentrações mais baixas resultaram em poros mais pequenos. Considerando que, no tamanho de poro do lado intraluminal foi re...

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo at JoVE.com

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Neste vídeo, vamos demonstrar técnicas de modificação de implantes metálicos porosos para melhorar a sua funcionalidade e para controlar a migração celular. As técnicas incluem o desenvolvimento de gradientes de poros para controlar o movimento de células em 3D e a produção da membrana basal imita para controlar o movimento de células em 2-D. Além disso, um método baseado em HPLC para o acompanhamento da integração do implante in vivo através de análise de proteínas do sangue é descrito.

Modificação Multi-Escala de implantes metálicos com gradientes de poros, polieletrólitos e sua monitorização indirecta<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

multi-scale-modification-metallic-implants-with-pore-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

10.8K visualizações.  INSERM. Neste vídeo, vamos demonstrar técnicas de modificação de implantes metálicos porosos para melhorar a sua funcionalidade e para controlar a migração celular. As técnicas incluem o desenvolvimento de gradientes de poros para controlar o movimento de células em 3D e a produção da membrana basal imita para controlar o movimento de células em 2-D. Além disso, um método baseado em HPLC para o acompanhamento da integração do implante in vivo através de análise ...

Vídeo: Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Bioengenharia

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene for applications as a stent material. Graphene was grown on copper substrates via chemical vapor deposition and then transferred onto nitinol substrates. In order to understand how the graphene coating could change biological response, cell viability of rat aortic endothelial cells and rat aortic smooth muscle cells was investigated. Moreover, the effect of graphene-coatings on cell adhesion and morphology was examined with fluorescent confocal microscopy. Cells were stained for actin and nuclei, and there were noticeable differences between pristine nitinol samples compared to graphene-coated samples. Total actin expression from rat aortic smooth muscle cells was found using western blot. Protein adsorption characteristics, an indicator for potential thrombogenicity, were determined for serum albumin and fibrinogen with gel electrophoresis. Moreover, the transfer of charge from fibrinogen to substrate was deduced using Raman spectroscopy. It was found that graphene coating on nitinol substrates met the functional requirements for a stent material and improved the biological response compared to uncoated nitinol. Thus, graphene-coated nitinol is a viable candidate for a stent material.

Graphene offers potential as a coating material for biomedical implants. In this study we demonstrate a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene and determine how graphene may influence implant response.

Revestimentos de grafeno para implantes biomédicos

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Técnica Cirúrgica para a Implantação de engenharia de tecidos enxertos vasculares e Subsequente<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Geração de escalável e de alto-Aspect Metallic nanocompósitos índices, em um Biológico Líquido Médio

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of this new field of biomaterials research is due to the necessity to develop implants capable of mimicking the complex functionality of the various tissues, including a continuous change from one structure or composition to another. In this latter context, one topic of main interest concerns the design of appropriate scaffolds for bone-cartilage interface tissue. In this study, three-layered scaffolds with graded pore size were achieved by melt mixing poly(lactic acid) (PLA), sodium chloride (NaCl) and polyethylene glycol (PEG). Pore size distributions were controlled by NaCl granulometry and PEG solvation. Scaffolds were characterized from a morphological and mechanical point of view. A correlation between the preparation method, the pore architecture and compressive mechanical behavior was found. The interface adhesion strength was quantitatively evaluated by using a custom-designed interfacial strength test. Furthermore, in order to imitate the human physiology, mechanical tests were also performed in phosphate buffered saline (PBS) solution at 37 &#176;C. The method herein presented provides a high control of porosity, pore size distribution and mechanical performance, thus offering the possibility to fabricate three-layered scaffolds with tailored properties by following a simple and eco-friendly route.

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

In this work, poly(lactic acid)/polyethylene glycol (PLA/PEG) scaffolds were prepared by using a combination of melt mixing and selective leaching. The method herein discussed permitted to develop three-layer scaffolds by highly controlling both porosity and pore size. The mechanical properties were also evaluated in a physiological environment.

A Facile e Eco-friendly rota para fabricar poli (ácido láctico) Scaffolds com Graded Pore Tamanho

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Síntese de nanotubos de carbono de paredes Multi modificados com nanopartículas de prata e avaliação das suas actividades antibacterianas e propriedades citotóxicas

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...