O isolamento e proliferação de células-tronco derivadas do tecido adiposo produz um grande número de células-tronco que podem ser usadas para várias aplicações a jusante e técnicas experimentais. Um dos principais usos pretendidos para adipócitos diferenciados neste protocolo são ensaios metabólicos, como captação de glicose estimulada por insulina, lipogênese e lipólise estimulada. Para começar, crie um ambiente de trabalho estéril desinfetando o exaustor de biossegurança e todas as ferramentas.
Pipetar aproximadamente 10 mililitros de cinco PBS tampão em quatro placas de cultura celular de 100 milímetros. Transfira uma amostra adiposa de 50 gramas para um dos pratos e lave-a quatro vezes, transferindo-a sequencialmente através dos outros pratos contendo cinco PBS. Em seguida, transfira o tecido adiposo lavado para um prato de cultura limpo de 100 milímetros e pice-o completamente usando tesouras ou pinças estéreis.
Transfira uma seção de um a três centímetros do tecido picado para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 13 mililitros de tampão colagenase. Lave o tecido restante do prato de cultura com dois mililitros de tampão colagenase para garantir um volume total de 15 mililitros. Misture bem a amostra usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros e incube o tubo a 37 graus Celsius em um balancim por 30 a 60 minutos.
Para neutralizar a atividade enzimática, adicione 10 mililitros de meio de crescimento ADSC no tubo após a incubação e misture-o bem com uma pipeta para separar quaisquer agregados teciduais. Transfira a porção líquida para um novo tubo cônico estéril de 50 mililitros, deixando o tecido sólido. Lave o tecido três vezes usando sete mililitros de dois PBS e transfira o líquido para o novo tubo.
Em seguida, centrifugar o tubo a 500 vezes G por cinco minutos e remover cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível sem perturbar o pellet. Ressuspeite o pellet em um mililitro de 1X de hemácias ou tampão de lise RBC e incube-o à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as células duas vezes, adicionando cinco mililitros de meio de crescimento ADSC ao tubo e centrifugando para remover o sobrenadante.
Após a última lavagem, ressuscite o pellet em dois mililitros de meio de crescimento ADSC e filtre-o através de um filtro de células de 70 mícrons em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Lave o coador com mais dois mililitros do meio e transfira quatro mililitros da suspensão para um prato de cultura estéril de 100 mililitros. Lave o tubo cônico duas vezes com três mililitros de meio para coletar um volume total de 10 mililitros no prato de cultura.
Observe as células coletadas sob um microscópio invertido com ampliação de 10X para verificar se há células flutuantes. Incubar as células por 24 horas em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade relativa. Para garantir a esterilidade dos meios de cultura, inclua um prato apenas com mídia.
Após 24 horas, veja as células sob o microscópio invertido para verificar a aderência celular. Retire e substitua o meio por meio morno a cada 48 horas até que as células estejam 80 a 90% confluentes. Para proliferação, remova o meio de crescimento das células ADSC confluentes e lave-as duas vezes com dois mililitros de PBS estéril à temperatura ambiente.
Aspirar o PBS e adicionar dois mililitros de EDTA de tripsina a 0,25% em cada placa de cultura, cobrindo toda a área de superfície da placa. Incubar a placa por sete minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, em seguida, desalojar mecanicamente as células tripsinizadas por pipetagem forçada. Adicione dois mililitros de meio de crescimento ADSC e misture suavemente as células.
Transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros, enxaguando o prato com mais dois mililitros de meio para garantir a máxima recuperação celular da placa. Em seguida, centrifugar o tubo a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente e decantar o sobrenadante para obter o pellet celular. Ressuscite o pellet celular em cinco a seis mililitros de meio de crescimento ADSC por milhão de células.
Conte as células usando um hemocitômetro e plaquee-as conforme descrito no manuscrito do texto. Uma vez que as células atinjam 80 a 90% de confluência, aspirar o meio de crescimento e enxaguar as células com PBS estéril à temperatura ambiente, em seguida, adicionar 10 mililitros de meio de diferenciação ADSC. Substitua o meio a cada três dias por aproximadamente 14 a 21 dias.
Observe as células quanto à presença de gotículas lipídicas sob o microscópio invertido com ampliação de 40X. Os adipócitos maduros são geralmente observados após 14 dias. No dia do chapeamento, os ADSCs não eram aderentes e flutuavam na cultura.
As células tornaram-se 80% confluentes após 72 horas e estavam prontas para diferenciação de adipócitos. Após 14 dias de diferenciação do ADSC, os adipócitos maduros apresentaram fortes características adipogênicas que foram observadas sob ampliação de 40X. No 14º dia, as células foram coradas e fixadas com Oil Red O e BODIPY para visualização de gotículas lipídicas.
Adipócitos diferenciados puderam ser observados sob ampliação de 20X. Ao tentar este protocolo, é importante lembrar que um ambiente de trabalho estéril é fundamental para o isolamento saudável, expansão adequada e diferenciação eficiente de células-tronco derivadas de tecido adiposo. Após este procedimento, essas células podem ser usadas para vários ensaios metabólicos, como captação de glicose, lipogênese e lipólise, que é um dos principais focos de nossa pesquisa.
Essa técnica permite a investigação de como o álcool crônico e o SIV impactam a capacidade metabólica dos adipócitos.
