TO e TD foram apoiados pelos números de subvenção JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999, respectivamente.

1. Manutenção de colônias de laboratório
<ol><li>Para a manutenção de populações selvagens e mutantes, utilize um grande recipiente plástico (460 mm x 360 mm x 170 mm) com alimentos regulares de peixe artificial, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para colocação de ovos(Figura 2A). Mantenha todas as culturas T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C e coloque a umidade relativa do ar (RH) dentro de cada recipiente para 60%-80%. NOTA: Como t. domestica absorve vapor de água da atmosfera11,um fornecimento direto de água não é necessário. O RH apropriado é mantido devido à presença de vapor de água de copos plásticos contendo um orifício de ventilação na parte superior ou de copos sem tampa dentro de cada recipiente. Não há necessidade de umidificar dentro de uma incubadora inteira que contém culturas. A duração aproximada de cada estágio de desenvolvimento sob a condição descrita neste protocolo é mostrada na Figura 1. A velocidade de desenvolvimento poderia ser ajustada alterando a temperatura e/ou RH12.</li>
	<li>Adicione comida periodicamente. Adicione água antes que se doe.</li>
	<li>Transfira as populações para um novo recipiente limpo pelo menos a cada 3 meses, dado que os adultos param de colocar ovos em um ambiente sujo e/ou população densa (ver Discussão).</li>
</ol>2. Coleta de ovos e microinjeção
<ol><li>Projete um RNA guia (gRNA)<ol>
<li>Projete uma sequência de gRNA para cada alvo necessário e BLAST as sequências de gRNA contra o conjunto do genoma para verificar possíveis locais de reconhecimento fora do alvo.</li>
		<li>Sintetizar e purificar as gRNAs de acordo com as instruções do fabricante8. NOTA: Como exemplo, no caso de direcionar o gene branco do transportador de de ligação ATP, foi projetada uma sequência de alvos de 20 bps e dois oligonucleotídeos de DNA sintetizados 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCACACACACACACTTA-3' foram ordenados. O modelo de DNA foi preparado por annealing esses dois oligonucleotídeos seguidos de amplificação PCR e o gRNA é então in vitro transcrito do modelo com uma polimerase T7 RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare colônias de coleta de ovos<ol>
<li>Transfira cerca de 20 adultos do sexo masculino e 20 do sexo feminino para um recipiente de tamanho médio (200 mm x 150 mm x 90 mm) com alimentos, abastecimento de água, papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para a colocação de ovos(Figura 2B).</li>
		<li>Configure várias colônias para obter um grande número de embriões encenados em um curto período de tempo para serem usados para a edição de genomas. NOTA: Cerca de 20 a 40 ovos devem ser coletados de uma colônia após 8h a 37 °C. Geralmente leva alguns dias para os adultos transferidos começarem a colocar ovos, possivelmente devido à adaptação a um novo ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por novos.</li>
	<li>Coloque uma fita de 76 mm x 5 mm de dupla face em uma lâmina de vidro normal de 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Oito horas depois, recolhe os ovos do algodão em camadas separando as camadas usando fórceps.</li>
	<li>Alinhe os ovos na fita de dois lados usando um pincel de tinta molhada e mantenha uma distância de 2 mm entre os ovos. Todos os ovos devem ser orientados para que o eixo longitudinal de um ovo enfrente o lado da injeção(Figura 3A). Pressione suavemente os ovos com uma escova de tinta para segurar firme durante a injeção. NOTA: Neste protocolo, o fungo cresce rapidamente em ovos injetados danificados em condições molhadas e quentes. É importante manter a distância entre os ovos para evitar contaminação cruzada e expansão de fungos.</li>
	<li>Misture a proteína gRNA e Cas9 a uma concentração final de 100 ng/μL e 500 ng/μL, respectivamente. Use água destilada para diluição. Incubar a mistura por 10 minutos à temperatura ambiente para promover a formação complexa da ribonucleoproteína e, em seguida, manter a mistura no gelo. NOTA: O vermelho neutro a uma concentração final de 1% pode ser adicionado à solução de injeção para monitorar a quantidade injetada.</li>
	<li>Carregue 2 μL da solução gRNA/Cas9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador. Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, toque na agulha para remover as bolhas. NOTA: Neste experimento, uma agulha pronta é usada para obter uma ponta fina de agulha(Figura 3B). Uma agulha caseira com uma forma semelhante poderia ser usada em vez disso.</li>
	<li>Fixar o capilar de injeção de vidro, previamente carregado com a solução gRNA/Cas9, a um suporte equipado com um manipulador e conectar o suporte a um microinjetor eletrônico.</li>
	<li>Otimize a forma da ponta da agulha, quebrando-a ligeiramente com fórceps para evitar entupimento e melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções (um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 3C). NOTA: Recomenda-se trocar uma agulha quando estiver entupida. É possível continuar injetando com a mesma agulha se for quebrada novamente com fórceps, mas uma ponta mais larga leva a mais danos aos ovos e reduz sua taxa de sobrevivência. Como os ovos T. domestica são macios e frágeis, manter uma ponta fina de agulha é fundamental para ter uma alta taxa de sobrevivência após a injeção.</li>
	<li>Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução (ver Figura 3D-H para referência sobre a quantidade de injeção). Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo da forma da ponta da agulha. NOTA: Recomenda-se aplicar uma pressão constante durante a injeção, caso contrário, o conteúdo de ovos pegajoso pode facilmente fluir para dentro da agulha de vidro e pode entupi-lo. A solução pode ser injetar com um pulso de pressão curta ou com uma pressão constante, dependendo da quantidade de líquido injetado. Tenha em mente que quando uma ponta de agulha tem uma abertura larga, muita solução é injetada em um ovo, o que causa letalidade(Figura 3F-H). Nesse caso, mantenha um fluxo líquido constante por pressão constante, em seguida, insira a agulha em um ovo e puxe-a imediatamente. Se causar muito transbordamento ou o ovo estourar, troque a agulha.</li>
	<li>Mantenha os ovos injetados em um recipiente com o tamanho adequado para o número de ovos injetados (<20 ovos: prato pequeno; >20 ovos: recipiente de tamanho médio) com 60%-80% RH e 37 °C.</li>
</ol>3. Acasalamento
<ol><li>Verifique periodicamente os ovos injetados e descarte ovos danificados com fórceps para evitar o crescimento fúngico(Figura 3I,J). No caso de muito fungo está crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de EtOH.</li>
	<li>Antes de eclodir (aproximadamente 10 dias a 37 °C após a colocação do ovo), mergulhe o deslizamento de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita de dois lados. Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira os slides de vidro revestidos em pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado para esconder os insetos.</li>
	<li>Remova as lâminas de vidro depois que as ninfas chocarem. Forneça periodicamente alimentos até chegarem à idade adulta. NOTA: Leva cerca de 2,0-2,5 meses para os indivíduos chegarem à idade adulta após a eclosão(Figura 1A). A fase adulta é julgada com base em um ovipositor bem desenvolvido em fêmeas(Figura 1B).</li>
	<li>Para acasalar os indivíduos, transfira quantos adultos fêmeas precisam de uma colônia de laboratório para o recipiente de tamanho médio e incuba-os por pelo menos 14 dias a 37 °C para ter certeza de que são virgens. NOTA: Não é necessário coletar fêmeas virgens de uma colônia de laboratório porque a T. domestica adulta tem um ciclo repetido de molting e acasalamento chamado "ciclo reprodutivo e de fusão", durante o qual as fêmeas jogam fora esperma com cada molt e mate novamente no próximo ciclo de fertilização13.</li>
	<li>Transfira um macho ou uma fêmea G0 adulto que se desenvolveu de um ovo injetado e um adulto wildtype(s) para um pequeno prato plástico (Ø 100 mm x 40 mm) com alimentos, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão para a colocação de ovos G1(Figura 2C'; prato de acasalamento). Mantenha os pratos de acasalamento em um recipiente maior com 60%-80% RH(Figura 2C). NOTA: Vários adultos selvagens podem ser incluídos em um prato para aumentar a chance de acasalamento bem sucedido, embora altas taxas de sucesso tenham sido alcançadas com um par.</li>
</ol>4. Genotipagem
<ol><li>Design pcr primer pares para cada gRNA para amplificar um produto de 100-200 bp que inclui o site visado pelo gRNA. BLAST cada sequência de primer contra o conjunto do genoma para verificar sua especificidade (um exemplo é mostrado para o direcionamento do gene branco na Figura 4A).</li>
	<li>Verifique a transformação germinal dos adultos G0.<ol>
<li>Cinco dias após a colocação dos ovos, colete ovos G1 individuais de cada par adulto G0 em tubos de 0,2 mL (um ovo por tubo; armazene amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). Separe as camadas de algodão para coletar os ovos. NOTA: Recomenda-se genótipo pelo menos 12 ninfas G1 de cada par de acasalamento para avaliar o sucesso da transmissão germinal (ver Resultados Representativos).</li>
		<li>Adicione 15 μL de uma solução Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissolvida em tampão Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneize brevemente amostras com palitos de dente e incubar a 55 °C por 3 a 16 h.</li>
		<li>Inative o Proteinase K colocando as amostras a 95 °C por 10 minutos.</li>
		<li>Adicione 90 μL de água destilada em cada tubo e misture bem. Use 2 μL de supernasário em uma mistura de reação PCR de 10 μL contendo os primers projetados na etapa 4.1. NOTA: Recomenda-se o uso de uma polimerase de DNA otimizada para modelos brutos para atingir amplificação pcr suficiente.</li>
		<li>Para analisar os produtos PCR, realize um ensaio de mobilidade heteroduplex (HMA) com um sistema de eletroforese de microchip(Figura 3B; ver Ohde et al., 2018)8. NOTA: As mutações podem ser avaliadas com dois métodos alternativos: (1) HMA com polímeros de gel padrão, como 8% poliacrilamida14; (2) digestão de produtos PCR com endonuclease T7 seguida de eletroforese de gel agarose15.</li>
		<li>Mantenha apenas as ninfas G1 resultantes de adultos G0 que contêm mutações em sua germe e descarte as outras.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipagem individual de ninfas/adultos do G1<ol>
<li>Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou um pincel de tinta. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior (por exemplo, o recipiente de tamanho médio utilizado neste protocolo) com abastecimento de água conforme descrito acima para manter um RH de 60%-80%(Figura 1D). Manter o fornecimento de alimentos de peixe regulares artificiais(Figura 1D).. NOTA: Embora esta etapa possa ser realizada em qualquer ponto de estágios ninfais e adultos, recomenda-se realizá-la após atingir a idade adulta e pouco antes do emparelhamento (>2,5 meses após a injeção; Figura 1B) porque é mais fácil manter os focos de incêndio em um recipiente grande. A criação individual é necessária para rastrear o genótipo de cada ninfa G1 nas etapas a seguir. Ninfas G1 do mesmo G0 adulto podem ter mutações diferentes.</li>
		<li>Aperte e puxe cerci e o filamento caudal de uma ninfa/adulto usando fórceps e colete-os em um tubo de 0,2 mL contendo 50 μL EtOH (armazene as amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). NOTA: As amostras de tecido são coletadas em EtOH porque evita a perda dessas pequenas amostras devido à eletricidade estática. Se for preciso parar o movimento dos insetos, anestesia a ninfa/adulto no gelo ao colher amostras de tecido. Como T. domestica não pode sobreviver após o resfriamento a longo prazo no gelo, não anestesia-os por mais de um minuto e imediatamente movê-los de volta à temperatura ambiente. A ablação do cerci e do filamento caudal não causa aumento da mortalidade.</li>
		<li>Coloque tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 °C para evaporar o EtOH.</li>
		<li>Repetir passos 4.2.2-4.2.5 para genotipagem.</li>
		<li>Envie os produtos PCR nos quais um padrão de banda mutante é observado para um serviço padrão de sequenciamento Sanger.</li>
		<li>Mantenha as ninfas/adultos do G1 com as mutações desejadas e descarte as outras (ver Figura 4C para um resultado de sequenciamento representativo).</li>
	</ol></li>
	<li>Cruze os adultos contendo as mutações desejadas em um prato de acasalamento e obtenha as próximas gerações para estabelecer uma cepa mutante homozigosa.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+organization+of+the+mushroom+bodies+of+Thermobia+domestica+(Zygentoma,+Lepismatidae):+Insights+into+mushroom+body+evolution+from+a+basal+insect.">Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect.</a> Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).</li><li>Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+functional+analysis+of+the+clock+genes,+Clock+and+cycle,+in+the+firebrat+Thermobia+domestica.">Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).</li><li>Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+RNAi+analysis+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica:+Distal-less+is+required+to+form+caudal+filament.">Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).</li><li>Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nymphal+RNAi+analysis+reveals+novel+function+of+scalloped+in+antenna,+cercus+and+caudal+filament+formation+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica.">Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica.</a> Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li><li>Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+heritable+targeted+mutagenesis+in+Thermobia+domestica:+A+genetic+tool+in+an+apterygote+development+model+of+wing+evolution.">CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution.</a> Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).</li><li>Nji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+odorant+receptor+gene+family+in+insects.">The origin of the odorant receptor gene family in insects.</a> eLife. 7, 1-13 (2018).</li><li>Noble-Nesbitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+balance+in+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).+Exchanges+of+water+with+the+atmosphere.">Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para a geração bem sucedida do mutante T. domestica desejado com CRISPR/Cas9, é primeiro importante coletar um número suficiente de embriões encenados para injeção. Para uma coleta constante de um número suficiente de ovos T. domestica, a chave é selecionar um tamanho apropriado do recipiente para ter uma densidade populacional menor, pois ajudaria a conclusão bem sucedida de uma série de comportamentos complexos de acasalamento, que se repete após cada moltadulto 13....

A termobia domestica pertence a uma das ordens mais basais de insetos, zygentoma, que mantém um ciclo de vida ancestral ametabolous e sem asas. Tal posição filogenética basal e características ancestrais definem esta espécie como um modelo atraente para estudar os mecanismos subjacentes ao sucesso dos insetos na Terra, que cobrem mais de 70% das espécies animais descritas1. A T. domestica tem sido usada há muito tempo para estudar características ancestrais da fisiologia de insetos devido às suas características adequadas como modelo de laboratório, como um ciclo de vida relativamente curto (2,5-3,0 meses de embrião a adulto reprodutivo; Figura 1A) e uma criação fácil. Nas últimas três décadas, seu uso foi expandido para investigar características ancestrais de vários traços, como plano corporal, diferenciação neural e ritmos circadianos2,3,4.
A aplicação de ferramentas genéticas avançadas em T. domestica poderia acelerar ainda mais tais contribuições em uma ampla área de pesquisa. A interferência de RNA bem sucedida (RNAi) mediada por danos genéticos em embriões, ninfas e adultos foi relatada em T. domestica4,5,6. A eficiência do RNAi sistêmico ainda é altamente dependente de espécies — por exemplo, é geralmente alta em coleoptera, enquanto é baixa na ordem lepidoptera7. A eficiência e duração do knockdown rnai em T. domestica ainda está para ser avaliada. Além da RNAi, já reportamos um nocaute genético bem sucedido no CRISPR/Cas9 mediado em T. domestica8. O sistema CRISPR/Cas tem sido amplamente aplicado para edição de genomas em insetos particularmente para nocaute genético direcionado. Seu uso poderia ser expandido para outras aplicações, como ensaio de repórteres genéticos, rastreamento de linhagem celular e manipulação da atividade transcricional, derrubando construções exógenas após o estabelecimento de um protocolo para a entrega de componentes do sistema CRISPR/Cas em núcleos9. Combinado com o conjunto de genomas publicado10,o amplo uso e o desenvolvimento da edição de genoma baseada em CRISPR/Cas em T. domestica facilitaria estudos com foco nos mecanismos evolutivos por trás do excelente sucesso adaptativo dos insetos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para microinjeção de embriões e para acasalamento adulto T. domestica para gerar uma cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Considerando este novo método, discutimos a importância de considerar a biologia única de espécies modelos não tradicionais para aplicações bem sucedidas dessas técnicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

O firebrat Thermobia domestica é uma espécie ametabolous, sem asas, que é adequada para estudar os mecanismos de desenvolvimento de insetos que levaram à sua radiação evolutiva bem sucedida na Terra. A aplicação de ferramentas genéticas como a edição de genomas é a chave para entender as mudanças genéticas responsáveis pelas transições evolutivas em uma abordagem Evo-Devo. Neste artigo, descrevemos nosso protocolo atual para gerar e manter cepas mutantes de T. domestica. Relatamos um método de injeção seca, como alternativa ao método de injeção molhada relatado, que nos permite obter altas taxas de sobrevivência em embriões injetados. Também relatamos uma configuração de ambiente otimizado para acasalar adultos e obter gerações subsequentes com alta eficiência. Nosso método ressalta a importância de levar em conta a biologia única de cada espécie para a aplicação bem sucedida de métodos de edição de genomas a organismos modelos não tradicionais. Prevemos que esses protocolos de edição de genomas ajudarão na implementação do T. domestica como modelo de laboratório e para acelerar ainda mais o desenvolvimento e a aplicação de ferramentas genéticas úteis nesta espécie.

Em nossas mãos, cerca de 100 ovos podem ser bem injetados com uma única injeção capilar quando tem a ponta adequada(Figura 3C). Injeção de complexo de ribonucleoproteína gRNA/Cas9 em embriões nas primeiras 8h após a colocação de ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialólicas em algumas células da geração injetada (G0) e, portanto, fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos em G0. Por exemplo, quando este protocolo foi usado para inje...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K visualizações.  Kyoto University. Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.

Vídeo: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...