O objetivo geral deste método é gerar um sistema de expressão direcionada altamente específico do tecido. Neste método, demonstramos a geração de um driver transcricional binário específico para o nosso homólogo Drosophila FGF, sem ramificações. Expressão dinâmica e esposte de sem ramificações regula hemogênese de epitélio traqueal das vias aéreas.
Embora este método possa fornecer uma visão da expressão espostetemporal e migração de células produtoras sem ramificações, ele pode ser facilmente aplicado a outros genes e tecidos em Drosophila ou em outros organismos modelo, como C.Elegans e zebrafish. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera sistemas de expressão altamente confiáveis, específicos de tecidos e genes, e ativos exclusivamente em células onde os elementos regulatórios cis do gene substituído são funcionais. Sistemas de transcrição binária são ferramentas essenciais para a expressão e manipulação genética direcionada.
Um ativador trans, como GAL4 ou LexA, expresso sob o controle de elementos regulatórios cis de um gene, impulsiona um gene trans efeitoor que é colocado a jusante de sites específicos de ligação de transcrição, como UAS para GAL4 e/ou LexO para LexA. Esta metodologia substitui o primeiro exon de codificação do gene sem ramificação pelo driver de transcrição. O método baseado em CRISPR Cas9 coloca uma sequência de ativador trans LexA sob a regulação endógena do gene sem ramificações e, consequentemente, facilita a expressão do ativador trans exclusivamente em padrões espáteis específicos sem ramificações.
Comece selecionando dois sites de destino guia RNA que visam especificamente duas extremidades da região de interesse selecionada. Abra a ferramenta de design CRISPR de escolha. Fly CRISPR Optimal Target Finder é usado aqui.
Clique em Select Genome'insira a sequência de interesse e selecione a mais recente anotação do genoma de melanogaster Drosophila, atualmente R sublinhar seis, no menu suspenso. Em seguida, clique em Selecionar comprimento de guia e entrada 20. Selecione Todos os alvos CRISPR e clique em Encontrar alvos CRISPR.
Avalie todas as metas de RNA do guiar candidatos definindo o máximo para stringency e NGG somente para PAM. Para gerar um vetor de expressão RNA de guia tandem, primeiro PCR amplifica um fragmento de DNA para introduzir duas sequências de espaçador proto em uma espinha dorsal vetorial de expressão RNA pCFD4. Use um primer para frente e para trás, cada um com uma sequência de espaçador proto, e sobreponha-se com a sequência vetorial pCFD4 em um PCR usando dna de polimerase de polimerase de alta fidelidade e pCFD4.
Para preparar pCFD4 para clonagem, digerir o plasmídeo com enzima Bbs1. Configure uma reação no tampão de digestão apropriado contendo dois a cinco microgramas de plasmídeo pCFD4 e um microliter de enzima Bbs1 e um volume final de 50 microlitradores. Misture o conteúdo da reação tocando o tubo e coletando todas as gotículas espalhadas da parede do tubo até o fundo por um breve giro.
Incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por duas horas depois de executar o produto PCR e digerir plasmídeo em um gel de 1% de agarose. Purifique o par linear plasmídeo linear de 6,4 quilobases e o produto PCR de 600 pares base usando colunas padrão de purificação de gel. Configure a reação de montagem de DNA de acordo com o protocolo do fabricante.
Para o knock-in genômico de uma sequência GAL4 ou LexA, projete um doador HDR de dupla vertente contendo a sequência do ativador trans, ladeado por dois braços de esmiologia. Para evitar redirecionar o RNA guia para o lócus projetado, projete o doador substituto de tal forma que os sites de reconhecimento de RNA guia sejam interrompidos pela sequência exógena introduzida. Além disso, para evitar alterar a pureza dos elementos regulatórios cis, selecione sempre os sites de reconhecimento de RNA guia dentro da região de codificação exon.
Para gerar um de substituição, planeje a estratégia de montagem de DNA para unir quatro segmentos. Os cinco braços de epílogo e três principais, a sequência de DNA do ativador trans exógeno médio, e a espinha dorsal vetorial de clonagem linearizada. PcR amplificar um de expressão GAL4 ou LexA de um vetor apropriado e PCR amplificar os braços de ecologia do DNA genômico extraído da linha de mosca pai selecionada para injeção.
Use polimerase de alta fidelidade em cada PCR para gerar os fragmentos de destino. Para configurar a reação de montagem de DNA, misture o vetor de clonagem linearizada e fragmentos de destino gerados pela clonagem pcr com o conjunto de DNA mastermix e um volume final de reação a 20 microliters de acordo com as instruções do fabricante. Incubar a mistura de reação por uma hora a 50 graus Celsius.
Quando os embriões Nos-Cas9 injetados anteriormente com a expressão guia RNA plasmid e o doador substituto, desenvolvem-se em adultos, cruzam g0 voa individualmente para equilibrar suas moscas de uma linha apropriada para o alelo-alvo. Anestesiar a prole F1 de cada cruz G0 em uma almofada de dióxido de carbono. Escolha aleatoriamente de 10 a 20 machos sob um microscópio estéreo.
Cruze individualmente cada macho selecionado para uma fêmea balanceadora de uma linha apropriada para o alelo-alvo. Quando as larvas F2 chocarem, escolha o pai f1 de cada cruz. Extrair DNA genômico esmagando cada mosca por 10 a 15 segundos com uma ponta de pipeta, contendo 50 microliters de tampão de squishing sem dispensar o buffer.
Em seguida, dispense o tampão restante no tubo e misture bem. Incubar a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Após a incubação, coloque os tubos em bloco de calor de 95 graus Celsius por um a dois minutos para inativar a proteína K.Depois de girar por cinco minutos a 10.000 vezes G, armazene a preparação a quatro graus Celsius para uma análise pcr adicional.
Execute telas baseadas em PCR de três etapas usando primers para frente e reverta uma para tela para a existência da inserção ou substituição. Execute o PCR usando dois primers para frente e inverta dois primers para verificar a inserção ou substituição da região três prime. Execute o PCR usando primers M13F e inverta três para verificar o 'HDR' de extremidades.
Mantenha as linhas de voo com o hdr de extremidades confirmados e estabeleça estoques equilibrados da geração F2. O balanceador voa novamente para remover qualquer mutação não intencional em outros cromossomos. Branchless, ou expressão bnl, é mostrado aqui em vermelho no terceiro disco de asa larva instar, com o receptor células expressando sem fôlego, mostrado em verde, no crescente sac de ar primordium.
As células expressas sem ramificações são mostradas aqui no ramo conectivo transverso TR5 e no ramo dorsal TR2. Células traqueais expressas sem fôlego são mostradas aqui em verde. As células expressas sem fôlego são mostradas em verde, marcando a traqueia embrionária em desenvolvimento do estágio nove ao estágio 14 e as células expressas sem ramificações são mostradas em vermelho.
Esta imagem mostra expressão sem ramificações induzida em locais de tecido ectópico em condições hipóxiis, em relação ao controle. Este método foi projetado para manter todos os regulamentos espáteis originais da transcrição genética sem ramificações. Por isso, era importante substituir apenas o primeiro exon de codificação do gene pela sequência de codificação trans activator LexA.
Após seu desenvolvimento, este novo conjunto de ferramentas genéticas abriu o caminho para explorar novos padrões de expressão tecidual do gene sem ramos. Também permitiu a má expressão genética e derrubou exclusivamente em células expressas sem ramificações e ajudou no monitoramento da migração linear e nas interações de sinalização das células.
