Este trabalho foi apoiado por uma National Institutes of Health subvenção NIDDK (K01DK092320) e financiamento de arranque do Departamento de Pediatria da Universidade do Texas McGovern Medical School.

O seguinte protocolo foi aprovado pela Universidade do Texas Health Science Center em Center em Houston para o Comitê de Animais de Laboratório de Medicina Animal Welfare, que serve como o Cuidado Institucional e Use Committee (protocolo nº: HSC-AWC-13-135). 1. Identificação e Seleção de Blastômeros para injectáveis ​​alvo de rim <ol><li> Antes de gerar embriões, o uso de mesa normal de Xenopus 21 Desenvolvimento de compreender a orientação das divisões celulares precoces no embrião. Alternativamente, diagramas de acesso dos primeiros estágios de desenvolvimento de Xenopus em Xenbase 11. </li><li> Acessar os mapas destino celular interativos Xenopus sobre Xenbase 11 para selecionar quais blastomere vai ser alvo de microinjeção. </li><li> Observe que o embrião unicelular tem um pólo animais mais pigmentadas e um pólo vegetal, que é branco e yolky. Note-se que uma membrana de protecção, conhecido como o vitelina envelope, abrange o embrião. </li><li> Note-se que a primeira clivagem ocorre normalmente entre os lados esquerdo e direito do embrião. Estas células contribuem igualmente para a linhagem pronephric. </li><li> Note-se que a segunda clivagem divide dorsal e ventral metades do embrião, levando a um embrião de quatro células. As células dorsais são mais pequenos e têm menos pigmento do que as células ventrais (Figura 2A e a Figura 3A). <ol><li> Identificar os blastômeros ventral (V; as células grandes, escuros) nas laterais esquerda e direita, que contribuem mais para o rim em desenvolvimento do que o dorsal (D; células pequenas e leves) blastômeros (Figura 2A). </li><li> Se a injeção em um embrião de 4 células, injetar o blastomere ventral esquerdo para atingir o rim esquerdo (Figura 3A e Seção 3). </li></ol></li><li> A terceira clivagem bissecta os lados do animal e vegetal, resultando em um embrião de oito células. Neste ponto, há quatro blastômeros animais [esquerda e direita ventral(V1) e dorsal (D1)] e quatro blastómeros vegetais [ventral esquerda e direita (V2) e dorsal (D2)] (Figura 2B e Figura 3B). <ol><li> Localize os blastômeros, vegetais ventral (V2). Estes blastómeros contribuir mais para o rim desenvolvimento de quaisquer outras células nesta fase (Figura 2B). Para atingir o rim esquerdo de um embrião de 8 células, injetar no blastomere deixou V2 (Figura 3B e Seção 3). </li></ol></li><li> Observe que os quarto e quinto clivagens bissetriz os blastômeros animais e vegetais. Dois descendentes são geradas a partir de cada um blastómero, resultando em um embrião de 16 células. As células são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o V2 blastï¿½ero a partir da fase de 8 células dá origem a progénie V2.1 e V2.2 na etapa de 16 células (Figura 2C). A célula V2.2 no estágio de 16 células fornece a maior parte das células que contribuem para o desenvolvimento renal. </li><li> Observe os sexto e sétimo clivagens resultar em uma Embry 32 célulaso. Mais uma vez, dois descendentes são gerados a partir de cada blastomere, que são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o blastï¿½ero V2.2 a partir do estágio de 16 células dá origem a V2.2.1 e V2.2.2 na fase de 32 células. Existe um sistema de nomenclatura alternativa na fase de 32 células em que as células são identificados em quatro linhas como A, B, C, e D (de animal para vegetal), e em quatro colunas como 1, 2, 3, e 4 ( de dorsal para ventral). Assim, o blastomere V2.2.2, o que mais contribui para as pronephros em desenvolvimento, é chamado C3 sob este sistema de nomeação alternativo (Figura 2D). </li></ol> 2. Preparação de Embriões <ol><li> Preparar 50 ml de Solução Dejelly (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0). </li><li> Isolar ambos os testículos de um único rã macho de acordo com protocolos padrão 14. Colocar os testículos em um prato de 60 milímetros de Petri cheio com 10 ml de solução de armazenamento Testículos (1x Marc modificação de Ringer [MMR; 0,1 M de NaCl, KCl 2 mM, MgSO 4 1 mM, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES, pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% de albumina de soro bovino, 50 ug / ml de gentamicina). Armazenar os testículos a 4 ° C. Nota: Testículos pode ser armazenado por cerca de 7-10 dias a 4 ° C, mas a eficiência de fertilização irá diminuir o tempo os testículos foram armazenados. </li><li> Espremer um sapo fêmea para obter ovos de acordo com protocolos padrão 14. Recolher os ovos em um 100 milímetros placa de Petri. Deitar fora qualquer excesso de água. </li><li> Cortado ¼ de um testículo enquanto ele está em Testes solução de armazenamento usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Transferir o pedaço de testículo para a placa de Petri contendo os ovos. Ajustar o tamanho da porção de testículo usado para contabilizar o tamanho do testículo, quanto tempo o testículo foi armazenado, e quantos os ovos devem ser fertilizado. Geralmente usam ¼ a 1/3 de um testículo recém-dissecados para fertilizar uma ninhada de ovos. </li><li> Corte a parte de testículo em pedaços pequenos usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Adicionar o suficiente MMR 0,3x+ 30 mg / ml de gentamicina para a placa de Petri para cobrir os ovos. Agitar o MMR no prato para misturar. </li><li> Aguarde cerca de 30 min para a fertilização ocorra à temperatura ambiente. Note-se que o hemisfério animais (pigmentado do lado do embrião) ficará por cima do embrião sobre a fertilização eficaz. Em seguida, retire a MMR a partir da placa de Petri com uma pipeta de transferência. Adicionar solução Dejelly suficiente para o prato para cobrir os embriões. </li><li> Ao longo dos próximos minutos, rode suavemente o prato de forma intermitente. A agitação vigorosa do prato neste momento pode causar defeitos de eixo. &#160; O casaco de geléia sobre os embriões se dissolverá, e os embriões se reúnem no centro do prato durante a roda. Uma vez que os embriões são intimamente tocar uns aos outros no centro do prato, remover a solução Dejelly com uma pipeta de transferência. Não deixe embriões na solução Dejelly por mais de 5 minutos, ou os embriões podem ser danificados. </li><li> Lavar os embriões dejellied 3 - 5 vezes em 0,3XMMR + 30 mg / ml de gentamicina com cuidado derramamento ou pipetagem fora da MMR e enchendo o prato com nova MMR. Não remova todo o MMR do prato, ou os embriões podem ser danificados. </li><li> Remova todos os ovos não fertilizados ou pedaços de testículo da placa de Petri com uma pipeta de transferência. </li><li> Incubar embriões entre 14 e 22 ° C. Nota: Os embriões cultivados a temperaturas mais baixas desenvolver mais lentamente do que os embriões cultivados a temperaturas mais elevadas. O sincronismo de fases de desenvolvimento pode ser encontrado no Xenbase 22. <ol><li> Para espaço para o seu desenvolvimento, lugar de metade dos embriões a partir de uma única fertilização em uma placa de Petri mantida a 14 ° C, e a outra metade dos embriões em uma placa de Petri mantida a 18 ° C. Isto permite que dois conjuntos de injecções em embriões de 4-celulares ou células-8 a partir de um único fertilização. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de soluções de injecção e microinjecção de embriões <ol><li> Prepare a solução para injecção contendo 0,01ng / nl de proteína ligada à membrana fluorescente vermelha (RFP-MEM) ARNm de 9, enquanto que os embriões estão em desenvolvimento para o estágio de 4 células ou de 8 células. Armazenar a solução injectável em gelo até estar pronto para injetar. </li><li> Carregar um &quot;tubo capilar de vidro de substituição em um extrator de agulhas, com a parte superior do tubo de substituição alinhado com a parte superior da caixa de agulha extrator. Defina o valor de calor # 2 a 800, eo valor de puxar para 650. Pressione o botão&quot; 7 puxe &quot;botão para retirar a agulha. Isto irá criar 2 agulhas de um único 7&quot; tubo capilar de vidro. </li><li> Cortando a ponta de uma agulha puxado com um par de fórceps Dumont. Nota: Depois de puxar a agulha, a dica é selada e deve ser cortado. Quanto mais próximo da ponta da agulha que é cortada, quanto menor for o diâmetro da ponta da agulha será. Embora o diâmetro da ponta não afectará o volume de injecção com o sistema de microinjecção utilizado aqui, uma ponta com um diâmetro maior é mais susceptível de danificar o embrião. </li><li> Deslize o mCollet icropipette na parte de trás da agulha. Em seguida, deslizar o orifício grande junta tórica para a parte de trás da agulha atrás da pinça. </li><li> Encha a agulha com óleo mineral utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 27, com cuidado para não obter bolhas de ar na agulha. </li><li> Deslizamento da agulha para o êmbolo da microinjetor, assentando a agulha no orifício grande do espaçador de plástico branco instalado no êmbolo. O êmbolo deve ter um pequeno anel de vedação mais próxima do corpo do microinjetor, seguido pelo espaçador branco, grande furo O-ring, e Collet. Fixe a agulha pelo aperto da pinça. Puxe suavemente a agulha para se certificar de que está devidamente protegidas. </li><li> Pressione e segure o botão &quot;vazio&quot; na caixa de controle microinjetor até há dois sinais sonoros. </li><li> Pipeta 3 uL de solução de injecção sobre um pedaço de Parafilm. Inserir a ponta da agulha para o talão da solução de injecção sobre o Parafilm. Pressione e segure o botão &quot;preencher&quot; no microinjector caixa de controlo para extrair a solução de injecção para dentro da agulha. </li><li> Encher um prato de 60 milímetros de Petri revestidas com 500 micra de malha de poliéster com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Cuidadosamente Pipetar 20 - 30 4-celulares ou células de embriões de 8 no prato. </li><li> Utilizando uma ansa de cabelo 14, manipular os embriões de modo que a blastómero para ser injectado está de frente para a agulha. Para atingir o rim esquerdo, alinhar os embriões de modo que os blastómeros ventral esquerdo de embriões 4-celulares ou as restantes blastómeros V2 de embriões de 8 células enfrentam a agulha. </li><li> Injectar 10 nl de uma solução de injecção no blastï¿½ero seleccionado de cada embrião no prato. Nota: A malha na parte inferior da placa de Petri estabiliza os embriões e os impede de laminagem, permitindo-lhes ser injectado, sem a utilização de um circuito de cabelo para a estabilização. </li><li> Transferência de embriões injectados nos poços de uma placa de cultura que foram preenchidos com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar a embriões injectadoss a 16 ° C durante pelo menos uma hora para permitir que os blastómeros injectados para curar. </li><li> Transferir os embriões curadas em poços de uma nova placa de cultura que tenham sido cheios com 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por etapa 9 (antes da gastrulação). </li><li> Incubar os embriões a 14-22 ° C, até atingir os embriões fase 38-40 21. </li></ol> 4. Fixação e imunocoloração de Embriões <ol><li> Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnésio / Formaldeído buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, 1 mM de MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldeído]. </li><li> Usando uma pipeta de transferência, colocado de 10 - 20 etapa 38 - 40 embriões num frasco de vidro. Adicionar 10 ul de 5% de benzocaína em etanol a 100% para o frasco e do frasco invertido para misturar. Aguarde 10 minutos para anestesiar os embriões. </li><li> Remover o MMR do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Se o processamento de vários frascos ao mesmo tempo, os frascos podem ser mantidos na posição vertical em uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Com um tubo de vidroTTE, encher o frasco com MEMFA. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Remover o MEMFA do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Encha o frasco com 100% de metanol. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 10 min à temperatura ambiente. Repetir esta etapa de lavagem mais uma vez, e armazenar os embriões em 100% de metanol durante a noite a -20 ° C. </li><li> Prepare 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato-Albumina de Soro Bovino Triton-(PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albumina de soro bovino, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Preparar a solução de anticorpo primário: 1x PBT com soro de cabra a 10%, com uma diluição 1: 5 do anticorpo monoclonal de ratinho 4A6 anticorpo (para etiquetar as membranas do intermediário, distais e túbulos de ligação 20), uma diluição de anticorpo monoclonal de ratinho 3G8 01:30 (a etiqueta lúmen dos túbulos proximais 20) e uma diluição 1: 250 de anticorpo policlonal de coelho RFP (para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare o secondaA solução de anticorpo RY: 1x PBT com soro de cabra a 10%, 1: 500 Alexa IgG 488 de cabra anti-ratinho (concentração de caldo de 2 mg / ml; a etiqueta 4A6 e 3G8), e 1: anti-IgG de coelho 500 Alexa 555 cabra (estoque concentração de 2 mg / ml; para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C, cobrindo o tubo em folha para proteger da luz. </li><li> Em alternativa, recolher os anticorpos primário e secundário, após coloração, e guardar a 4 ° C para reutilização em experiências futuras. Se o anticorpo é para ser salvo para reutilização, adicionar 0,01% de azida de sódio. </li><li> Imunocoloração os embriões utilizando protocolos estabelecidos 18. </li></ol> 5. Visualização de Embriões e Análise de Targeted Tissue Pronephric <ol><li> Peneirar os embriões imunocoradas para verificar que o blastï¿½ero correcto foi injectado através da visualização da fluorescência do marcador fluorescente sob um estereomicroscópio em 1X (para visualizar embrião inteiro) e 5X (para ler rim) de ampliação. embriões lugar em uma placa de vidro multi-bem com o quells cheios com 1x PBT utilizando uma pipeta de transferência com a ponta cortada. Manipular os embriões com um laço de cabelo. Utilizar apenas os embriões que possuem o marcador co-injectado presente nas pronephros no lado esquerdo do embrião (figura 3C, F e Figura 4C, F) para a sobre-expressão do gene ou análise knockdown. </li><li> Alternativamente, limpar os embriões no de Murray claro (2 partes de benzoato de benzilo: uma parte do álcool benzílico), colocando os embriões num frasco de vidro e enchimento do frasco com Murray claro. Visualize os embriões utilizando uma placa de vidro. Nota: Murray Clear é um solvente orgânico, e devem ser manuseados com cuidado. Usar luvas, e só usar frascos de vidro e pipetas com Murray Clear. </li><li> embriões armazenar a 4 ° C em 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para armazenamento a longo prazo de embriões, os embriões desidratar por lavagem duas vezes em 100% de metanol à temperatura ambiente durante 10 min. Armazenar os embriões a -20 ° C em metanol a 100%. </li></ol>

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<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Segmentação as pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus se baseia na identificação e injetar o blastomere correta. A injecção do blastómero V2 embriões de 8 células alvo os pronephros esquerda 18. Isso deixa os pronephros direito contralateral como um controlo interno. Se morfolino knockdown ou sobre-expressão de ARN é utilizada para alterar o desenvolvimento do rim, os pronephros direito contralaterais pode ser usado para comparar os efeitos de silenciamento de genes ou a sob...

O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros 1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mamíferos e anfíbios exigir os mesmos cascatas de sinalização e eventos indutivos se submeter nefrogênese 2, 3. Os pronephros Xenopus contém um único néfron composto por proximal, intermediário, distal e conectando túbulos, e um Glomus (análogo ao do glomérulo de mamífero) 1, 4-6 (Figura 1 </strong&gt;). A única, grande nefrónio presente nas pronephros Xenopus torna-o adequado como um modelo simples para o estudo de genes envolvidos em processos de desenvolvimento renal e doença. Mapas celular fate foram estabelecidas para embriões de Xenopus, e estão disponíveis gratuitamente on-line em Xenbase 7-11. Aqui, nós descrevemos uma técnica para microinjecção de marcadores de linhagem para direccionar o desenvolvimento de Xenopus pronephros, embora a mesma técnica pode ser adaptado para outros tecidos alvo tais como o coração ou olhos. marcadores de linhagem são etiquetas (incluindo corantes vitais, dextranos marcados com fluorescência, enzimas detectáveis ​​histoquimicamente, e ARNm que codificam as proteínas fluorescentes) que pode ser injectado num blastómero cedo, permitindo a visualização da descendência da célula que durante o desenvolvimento. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, membrana alvo que codifica a proteína fluorescente vermelha 12, como um marcador de linhagem. A tecnologia de microinjeção alvonicas para blastómeros individuais em embriões de células 4- 8 e descritas aqui podem ser utilizadas para injecção com morpholinos para derrubar a expressão do gene, ou com RNA exógeno para sobre-expressar um gene de interesse. Ao injectar no blastï¿½ero ventral, vegetal, principalmente as do embrião pronephros vai ser alvo, deixando os pronephros contralaterais como um controlo do desenvolvimento. Co-injeção de um traçador verifica se o blastomere correta foi injetado, e mostra que os tecidos no embrião surgiu a partir da blastomere injetado, verificando a segmentação dos pronephros. Imunocoloração das pronephros permite a visualização de quão bem os túbulos pronephric foram alvejados. A sobre-expressão e efeitos de knockdown pode então ser marcado contra o lado contralateral do embrião, o qual serve como um controlo de desenvolvimento, e podem ser usados ​​para calcular o índice pronephric 13. A disponibilidade de mapas destino celular permite que esta técnica de microinjecção objectivo de ser utilizada para os tecidos alvo othER do que os pronephros, e a co-injecção de um traçador fluorescente permite a micro-injecção direccionada para cada tecido a ser verificada antes da análise. Durante a microinjeção de embriões, a temperatura de desenvolvimento deve ser regulamentado firmemente, dado que a taxa de desenvolvimento de Xenopus é altamente dependente dele 14. Os embriões devem ser incubados a temperaturas mais baixas (14 - 16 ° C) para as injecções de células-4- 8 e porque o tempo de desenvolvimento é abrandado. A 22 ° C, o tempo de desenvolvimento de uma fase (1 célula) a fase 3 (4 células) é de aproximadamente 2 horas, enquanto que o tempo de desenvolvimento de 16 ° C para a fase 3 é de aproximadamente 4 horas. Demora cerca de 15 minutos para ir de um embrião de 4 células para uma célula-8 (etapa 4) de embriões a 22 ° C, mas demora cerca de 30 minutos a 16 ° C. Do mesmo modo, a 22 ° C, leva apenas 30 minutos para um embrião de 8 células de progredir para uma célula embrionária 16 (etapa 5). Este tempo é aumentado para 45 minutos a 16 ° C. oguinte, que é útil para diminuir a taxa de desenvolvimento dos embriões para permitir tempo suficiente para injecções na fase de 8 células antes de os embriões progredir para a fase de 16 células. Além disso, as temperaturas de crescimento pode ser modulada para acelerar ou retardar o desenvolvimento embrionário até o rim foi totalmente desenvolvido. A epiderme de girino em estágio embriões de Xenopus é relativamente transparente, permitindo a fácil imagem dos pronephros em desenvolvimento sem dissecção ou compensação do tecido 15. Devido à relativa transparência de embriões de Xenopus, imagens de células vivas também é viável 16,17. Todo-mount imunocoloração para visualizar as pronephros é possível com anticorpos estabelecidos que rotulam o proximal, intermediário, distal e túbulos de ligação de fase 38 - 40 embriões que permitem a avaliação do desenvolvimento pronephric depois alvo de manipulação da expressão do gene em embriões de Xenopus 18-20.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin solution, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Benchtop incubator for embryos.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP plasmid</td><td></td><td></td><td>For making tracer RNA. Ref: Davidson &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7&quot; Drummond replacement tubes</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Microinjection needles.</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>For breaking microinjection needle tip.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Microinjector.</td></tr><tr><td>Mineral oil, heavy</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Oil for needles.</td></tr><tr><td>27 G Monoject hypodermic needle</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 micron Polyester mesh</td><td>Small Parts</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td></tr><tr><td>6-well cell culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Screw thread vial</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>For fixing, staining, and storing embryos.</td></tr><tr><td>24-well cell Culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumen</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, model 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum, New Zealand origin</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 3G8 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label proximal tubules.</td></tr><tr><td>Monoclonal 4A6 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Secondary antibody to label kidney tubules.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>9 Cavity spot plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr></tbody></table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

O rim embrionário de Xenopus laevis (rã), os pronephros, consiste de uma única nefrónio, e pode ser usado como um modelo para a doença renal. Embriões de Xenopus são grandes, desenvolvem externamente, e pode ser facilmente manipulado por microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, mapas destino foram estabelecidas para embriões de Xenopus. microinjecção alvejado no blastï¿½ero indivíduo que irá, eventualmente, dar origem a um órgão ou tecido de interesse pode ser utilizado para sobre-expressar selectivamente ou derrubar a expressão do gene restrita dentro desta região, diminuição dos efeitos secundários no resto do embrião em desenvolvimento. Neste protocolo, descrevemos como utilizar estabelecidos mapas destino Xenopus para atingir o Xenopus rim em desenvolvimento (os pronephros), por microinjecção blastomere específico de embriões de células 8 4 e. A injecção de marcadores de linhagem permite a verificação de uma orientação mais precisa da injecção.Depois de embriões se desenvolveram para encenar 38-40, todo-mount imuno é usado para visualizar o desenvolvimento pronephric, ea contribuição de células-alvo para os pronephros pode ser avaliado. A mesma técnica pode ser adaptada para outros tipos de tecidos alvo para além dos pronephros.

Microinjeções de 4 e 8 células de embriões de Xenopus com MEM-RFP mRNA mostram diferentes níveis de segmentação para os pronephros. A Figura 4 mostra estágio 40 embriões com MEM-RFP padrões de expressão de mRNA corretas. Os embriões foram injectados na blastï¿½ero ventral esquerdo (Figura 4A), e classificadas para o padrão de expressão adequada de ARNm de MEM-RFP. Além de expressar MEM-RFP no sentido proximal, intermédio e dis...

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.2K visualizações.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Biologia do Desenvolvimento

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Biologia

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Neurais culturas de explante de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neurociência

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Gerando degeneração retiniana para investigar estratégias de reparo celular em Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair recently emerged as particularly appealing. A cellular source of interest for retinal repair is the M&#252;ller glial cell, which harbors stem cell potential and an extraordinary regenerative capacity in anamniotes. This potential is, however, very limited in mammals. Studying the molecular mechanisms underlying retinal regeneration in animal models with regenerative capabilities should provide insights into how to unlock the latent ability of mammalian M&#252;ller cells to regenerate the retina. This is a key step for the development of therapeutic strategies in regenerative medicine. To this aim, we developed several retinal injury paradigms in Xenopus: a mechanical retinal injury, a transgenic line allowing for nitroreductase-mediated photoreceptor conditional ablation, a retinitis pigmentosa model based on CRISPR/Cas9-mediated rhodopsin knockout, and a cytotoxic model driven by intraocular CoCl2 injections. Highlighting their advantages and disadvantages, we describe here this series of protocols that generate various degenerative conditions and allow the study of retinal regeneration in Xenopus.

Autor em destaque: explorando os mecanismos de regeneração da retina no sapo Xenopus 

We have developed several protocols to induce retinal damage or retinal degeneration in Xenopus laevis tadpoles. These models offer the possibility of studying retinal regeneration mechanisms.

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento

Resumo

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Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus