Este trabalho foi apoiado por uma National Institutes of Health subvenção NIDDK (K01DK092320) e financiamento de arranque do Departamento de Pediatria da Universidade do Texas McGovern Medical School.

O seguinte protocolo foi aprovado pela Universidade do Texas Health Science Center em Center em Houston para o Comitê de Animais de Laboratório de Medicina Animal Welfare, que serve como o Cuidado Institucional e Use Committee (protocolo nº: HSC-AWC-13-135). 1. Identificação e Seleção de Blastômeros para injectáveis ​​alvo de rim <ol><li> Antes de gerar embriões, o uso de mesa normal de Xenopus 21 Desenvolvimento de compreender a orientação das divisões celulares precoces no embrião. Alternativamente, diagramas de acesso dos primeiros estágios de desenvolvimento de Xenopus em Xenbase 11. </li><li> Acessar os mapas destino celular interativos Xenopus sobre Xenbase 11 para selecionar quais blastomere vai ser alvo de microinjeção. </li><li> Observe que o embrião unicelular tem um pólo animais mais pigmentadas e um pólo vegetal, que é branco e yolky. Note-se que uma membrana de protecção, conhecido como o vitelina envelope, abrange o embrião. </li><li> Note-se que a primeira clivagem ocorre normalmente entre os lados esquerdo e direito do embrião. Estas células contribuem igualmente para a linhagem pronephric. </li><li> Note-se que a segunda clivagem divide dorsal e ventral metades do embrião, levando a um embrião de quatro células. As células dorsais são mais pequenos e têm menos pigmento do que as células ventrais (Figura 2A e a Figura 3A). <ol><li> Identificar os blastômeros ventral (V; as células grandes, escuros) nas laterais esquerda e direita, que contribuem mais para o rim em desenvolvimento do que o dorsal (D; células pequenas e leves) blastômeros (Figura 2A). </li><li> Se a injeção em um embrião de 4 células, injetar o blastomere ventral esquerdo para atingir o rim esquerdo (Figura 3A e Seção 3). </li></ol></li><li> A terceira clivagem bissecta os lados do animal e vegetal, resultando em um embrião de oito células. Neste ponto, há quatro blastômeros animais [esquerda e direita ventral(V1) e dorsal (D1)] e quatro blastómeros vegetais [ventral esquerda e direita (V2) e dorsal (D2)] (Figura 2B e Figura 3B). <ol><li> Localize os blastômeros, vegetais ventral (V2). Estes blastómeros contribuir mais para o rim desenvolvimento de quaisquer outras células nesta fase (Figura 2B). Para atingir o rim esquerdo de um embrião de 8 células, injetar no blastomere deixou V2 (Figura 3B e Seção 3). </li></ol></li><li> Observe que os quarto e quinto clivagens bissetriz os blastômeros animais e vegetais. Dois descendentes são geradas a partir de cada um blastómero, resultando em um embrião de 16 células. As células são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o V2 blastï¿½ero a partir da fase de 8 células dá origem a progénie V2.1 e V2.2 na etapa de 16 células (Figura 2C). A célula V2.2 no estágio de 16 células fornece a maior parte das células que contribuem para o desenvolvimento renal. </li><li> Observe os sexto e sétimo clivagens resultar em uma Embry 32 célulaso. Mais uma vez, dois descendentes são gerados a partir de cada blastomere, que são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o blastï¿½ero V2.2 a partir do estágio de 16 células dá origem a V2.2.1 e V2.2.2 na fase de 32 células. Existe um sistema de nomenclatura alternativa na fase de 32 células em que as células são identificados em quatro linhas como A, B, C, e D (de animal para vegetal), e em quatro colunas como 1, 2, 3, e 4 ( de dorsal para ventral). Assim, o blastomere V2.2.2, o que mais contribui para as pronephros em desenvolvimento, é chamado C3 sob este sistema de nomeação alternativo (Figura 2D). </li></ol> 2. Preparação de Embriões <ol><li> Preparar 50 ml de Solução Dejelly (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0). </li><li> Isolar ambos os testículos de um único rã macho de acordo com protocolos padrão 14. Colocar os testículos em um prato de 60 milímetros de Petri cheio com 10 ml de solução de armazenamento Testículos (1x Marc modificação de Ringer [MMR; 0,1 M de NaCl, KCl 2 mM, MgSO 4 1 mM, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES, pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% de albumina de soro bovino, 50 ug / ml de gentamicina). Armazenar os testículos a 4 ° C. Nota: Testículos pode ser armazenado por cerca de 7-10 dias a 4 ° C, mas a eficiência de fertilização irá diminuir o tempo os testículos foram armazenados. </li><li> Espremer um sapo fêmea para obter ovos de acordo com protocolos padrão 14. Recolher os ovos em um 100 milímetros placa de Petri. Deitar fora qualquer excesso de água. </li><li> Cortado ¼ de um testículo enquanto ele está em Testes solução de armazenamento usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Transferir o pedaço de testículo para a placa de Petri contendo os ovos. Ajustar o tamanho da porção de testículo usado para contabilizar o tamanho do testículo, quanto tempo o testículo foi armazenado, e quantos os ovos devem ser fertilizado. Geralmente usam ¼ a 1/3 de um testículo recém-dissecados para fertilizar uma ninhada de ovos. </li><li> Corte a parte de testículo em pedaços pequenos usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Adicionar o suficiente MMR 0,3x+ 30 mg / ml de gentamicina para a placa de Petri para cobrir os ovos. Agitar o MMR no prato para misturar. </li><li> Aguarde cerca de 30 min para a fertilização ocorra à temperatura ambiente. Note-se que o hemisfério animais (pigmentado do lado do embrião) ficará por cima do embrião sobre a fertilização eficaz. Em seguida, retire a MMR a partir da placa de Petri com uma pipeta de transferência. Adicionar solução Dejelly suficiente para o prato para cobrir os embriões. </li><li> Ao longo dos próximos minutos, rode suavemente o prato de forma intermitente. A agitação vigorosa do prato neste momento pode causar defeitos de eixo. &#160; O casaco de geléia sobre os embriões se dissolverá, e os embriões se reúnem no centro do prato durante a roda. Uma vez que os embriões são intimamente tocar uns aos outros no centro do prato, remover a solução Dejelly com uma pipeta de transferência. Não deixe embriões na solução Dejelly por mais de 5 minutos, ou os embriões podem ser danificados. </li><li> Lavar os embriões dejellied 3 - 5 vezes em 0,3XMMR + 30 mg / ml de gentamicina com cuidado derramamento ou pipetagem fora da MMR e enchendo o prato com nova MMR. Não remova todo o MMR do prato, ou os embriões podem ser danificados. </li><li> Remova todos os ovos não fertilizados ou pedaços de testículo da placa de Petri com uma pipeta de transferência. </li><li> Incubar embriões entre 14 e 22 ° C. Nota: Os embriões cultivados a temperaturas mais baixas desenvolver mais lentamente do que os embriões cultivados a temperaturas mais elevadas. O sincronismo de fases de desenvolvimento pode ser encontrado no Xenbase 22. <ol><li> Para espaço para o seu desenvolvimento, lugar de metade dos embriões a partir de uma única fertilização em uma placa de Petri mantida a 14 ° C, e a outra metade dos embriões em uma placa de Petri mantida a 18 ° C. Isto permite que dois conjuntos de injecções em embriões de 4-celulares ou células-8 a partir de um único fertilização. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de soluções de injecção e microinjecção de embriões <ol><li> Prepare a solução para injecção contendo 0,01ng / nl de proteína ligada à membrana fluorescente vermelha (RFP-MEM) ARNm de 9, enquanto que os embriões estão em desenvolvimento para o estágio de 4 células ou de 8 células. Armazenar a solução injectável em gelo até estar pronto para injetar. </li><li> Carregar um &quot;tubo capilar de vidro de substituição em um extrator de agulhas, com a parte superior do tubo de substituição alinhado com a parte superior da caixa de agulha extrator. Defina o valor de calor # 2 a 800, eo valor de puxar para 650. Pressione o botão&quot; 7 puxe &quot;botão para retirar a agulha. Isto irá criar 2 agulhas de um único 7&quot; tubo capilar de vidro. </li><li> Cortando a ponta de uma agulha puxado com um par de fórceps Dumont. Nota: Depois de puxar a agulha, a dica é selada e deve ser cortado. Quanto mais próximo da ponta da agulha que é cortada, quanto menor for o diâmetro da ponta da agulha será. Embora o diâmetro da ponta não afectará o volume de injecção com o sistema de microinjecção utilizado aqui, uma ponta com um diâmetro maior é mais susceptível de danificar o embrião. </li><li> Deslize o mCollet icropipette na parte de trás da agulha. Em seguida, deslizar o orifício grande junta tórica para a parte de trás da agulha atrás da pinça. </li><li> Encha a agulha com óleo mineral utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 27, com cuidado para não obter bolhas de ar na agulha. </li><li> Deslizamento da agulha para o êmbolo da microinjetor, assentando a agulha no orifício grande do espaçador de plástico branco instalado no êmbolo. O êmbolo deve ter um pequeno anel de vedação mais próxima do corpo do microinjetor, seguido pelo espaçador branco, grande furo O-ring, e Collet. Fixe a agulha pelo aperto da pinça. Puxe suavemente a agulha para se certificar de que está devidamente protegidas. </li><li> Pressione e segure o botão &quot;vazio&quot; na caixa de controle microinjetor até há dois sinais sonoros. </li><li> Pipeta 3 uL de solução de injecção sobre um pedaço de Parafilm. Inserir a ponta da agulha para o talão da solução de injecção sobre o Parafilm. Pressione e segure o botão &quot;preencher&quot; no microinjector caixa de controlo para extrair a solução de injecção para dentro da agulha. </li><li> Encher um prato de 60 milímetros de Petri revestidas com 500 micra de malha de poliéster com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Cuidadosamente Pipetar 20 - 30 4-celulares ou células de embriões de 8 no prato. </li><li> Utilizando uma ansa de cabelo 14, manipular os embriões de modo que a blastómero para ser injectado está de frente para a agulha. Para atingir o rim esquerdo, alinhar os embriões de modo que os blastómeros ventral esquerdo de embriões 4-celulares ou as restantes blastómeros V2 de embriões de 8 células enfrentam a agulha. </li><li> Injectar 10 nl de uma solução de injecção no blastï¿½ero seleccionado de cada embrião no prato. Nota: A malha na parte inferior da placa de Petri estabiliza os embriões e os impede de laminagem, permitindo-lhes ser injectado, sem a utilização de um circuito de cabelo para a estabilização. </li><li> Transferência de embriões injectados nos poços de uma placa de cultura que foram preenchidos com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar a embriões injectadoss a 16 ° C durante pelo menos uma hora para permitir que os blastómeros injectados para curar. </li><li> Transferir os embriões curadas em poços de uma nova placa de cultura que tenham sido cheios com 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por etapa 9 (antes da gastrulação). </li><li> Incubar os embriões a 14-22 ° C, até atingir os embriões fase 38-40 21. </li></ol> 4. Fixação e imunocoloração de Embriões <ol><li> Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnésio / Formaldeído buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, 1 mM de MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldeído]. </li><li> Usando uma pipeta de transferência, colocado de 10 - 20 etapa 38 - 40 embriões num frasco de vidro. Adicionar 10 ul de 5% de benzocaína em etanol a 100% para o frasco e do frasco invertido para misturar. Aguarde 10 minutos para anestesiar os embriões. </li><li> Remover o MMR do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Se o processamento de vários frascos ao mesmo tempo, os frascos podem ser mantidos na posição vertical em uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Com um tubo de vidroTTE, encher o frasco com MEMFA. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Remover o MEMFA do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Encha o frasco com 100% de metanol. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 10 min à temperatura ambiente. Repetir esta etapa de lavagem mais uma vez, e armazenar os embriões em 100% de metanol durante a noite a -20 ° C. </li><li> Prepare 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato-Albumina de Soro Bovino Triton-(PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albumina de soro bovino, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Preparar a solução de anticorpo primário: 1x PBT com soro de cabra a 10%, com uma diluição 1: 5 do anticorpo monoclonal de ratinho 4A6 anticorpo (para etiquetar as membranas do intermediário, distais e túbulos de ligação 20), uma diluição de anticorpo monoclonal de ratinho 3G8 01:30 (a etiqueta lúmen dos túbulos proximais 20) e uma diluição 1: 250 de anticorpo policlonal de coelho RFP (para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare o secondaA solução de anticorpo RY: 1x PBT com soro de cabra a 10%, 1: 500 Alexa IgG 488 de cabra anti-ratinho (concentração de caldo de 2 mg / ml; a etiqueta 4A6 e 3G8), e 1: anti-IgG de coelho 500 Alexa 555 cabra (estoque concentração de 2 mg / ml; para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C, cobrindo o tubo em folha para proteger da luz. </li><li> Em alternativa, recolher os anticorpos primário e secundário, após coloração, e guardar a 4 ° C para reutilização em experiências futuras. Se o anticorpo é para ser salvo para reutilização, adicionar 0,01% de azida de sódio. </li><li> Imunocoloração os embriões utilizando protocolos estabelecidos 18. </li></ol> 5. Visualização de Embriões e Análise de Targeted Tissue Pronephric <ol><li> Peneirar os embriões imunocoradas para verificar que o blastï¿½ero correcto foi injectado através da visualização da fluorescência do marcador fluorescente sob um estereomicroscópio em 1X (para visualizar embrião inteiro) e 5X (para ler rim) de ampliação. embriões lugar em uma placa de vidro multi-bem com o quells cheios com 1x PBT utilizando uma pipeta de transferência com a ponta cortada. Manipular os embriões com um laço de cabelo. Utilizar apenas os embriões que possuem o marcador co-injectado presente nas pronephros no lado esquerdo do embrião (figura 3C, F e Figura 4C, F) para a sobre-expressão do gene ou análise knockdown. </li><li> Alternativamente, limpar os embriões no de Murray claro (2 partes de benzoato de benzilo: uma parte do álcool benzílico), colocando os embriões num frasco de vidro e enchimento do frasco com Murray claro. Visualize os embriões utilizando uma placa de vidro. Nota: Murray Clear é um solvente orgânico, e devem ser manuseados com cuidado. Usar luvas, e só usar frascos de vidro e pipetas com Murray Clear. </li><li> embriões armazenar a 4 ° C em 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para armazenamento a longo prazo de embriões, os embriões desidratar por lavagem duas vezes em 100% de metanol à temperatura ambiente durante 10 min. Armazenar os embriões a -20 ° C em metanol a 100%. </li></ol>

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	<li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+kidney+development:+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning.">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li><li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney.">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li><li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology.">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).</li><li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li><li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping.">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+stage+origin+of+Spemann's+Organizer:+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus.">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li><li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase,+the+Xenopus+model+organism+database;+new+virtualized+system,+data+types+and+genomes.">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li><li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension.">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li><li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precocious+expression+of+the+Wilms'+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis.">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros:+A+kidney+model+making+leaps+toward+understanding+tubule+development.">The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development.</a> Xenopus Development. , 215-238 (2014).</li><li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension.">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li><li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development.">Requirement of Wnt/&#946;-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li><li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling.">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li><li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Xenopus+pronephric+system.">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12:+The+Xenopus+Pronephros:+A+Kidney+Model+Making+Leaps+toward+Understanding+Tubule+Development.">Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development.</a> Xenopus Development. , (2014).</li><li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation.">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li><li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+(LFB1)+during+Xenopus+development.">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li><li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos.">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li><li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct.">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li><li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Na+,+K+-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo.">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical &amp; chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage.">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li><li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Segmentação as pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus se baseia na identificação e injetar o blastomere correta. A injecção do blastómero V2 embriões de 8 células alvo os pronephros esquerda 18. Isso deixa os pronephros direito contralateral como um controlo interno. Se morfolino knockdown ou sobre-expressão de ARN é utilizada para alterar o desenvolvimento do rim, os pronephros direito contralaterais pode ser usado para comparar os efeitos de silenciamento de genes ou a sob...

O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros 1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mamíferos e anfíbios exigir os mesmos cascatas de sinalização e eventos indutivos se submeter nefrogênese 2, 3. Os pronephros Xenopus contém um único néfron composto por proximal, intermediário, distal e conectando túbulos, e um Glomus (análogo ao do glomérulo de mamífero) 1, 4-6 (Figura 1 </strong&gt;). A única, grande nefrónio presente nas pronephros Xenopus torna-o adequado como um modelo simples para o estudo de genes envolvidos em processos de desenvolvimento renal e doença. Mapas celular fate foram estabelecidas para embriões de Xenopus, e estão disponíveis gratuitamente on-line em Xenbase 7-11. Aqui, nós descrevemos uma técnica para microinjecção de marcadores de linhagem para direccionar o desenvolvimento de Xenopus pronephros, embora a mesma técnica pode ser adaptado para outros tecidos alvo tais como o coração ou olhos. marcadores de linhagem são etiquetas (incluindo corantes vitais, dextranos marcados com fluorescência, enzimas detectáveis ​​histoquimicamente, e ARNm que codificam as proteínas fluorescentes) que pode ser injectado num blastómero cedo, permitindo a visualização da descendência da célula que durante o desenvolvimento. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, membrana alvo que codifica a proteína fluorescente vermelha 12, como um marcador de linhagem. A tecnologia de microinjeção alvonicas para blastómeros individuais em embriões de células 4- 8 e descritas aqui podem ser utilizadas para injecção com morpholinos para derrubar a expressão do gene, ou com RNA exógeno para sobre-expressar um gene de interesse. Ao injectar no blastï¿½ero ventral, vegetal, principalmente as do embrião pronephros vai ser alvo, deixando os pronephros contralaterais como um controlo do desenvolvimento. Co-injeção de um traçador verifica se o blastomere correta foi injetado, e mostra que os tecidos no embrião surgiu a partir da blastomere injetado, verificando a segmentação dos pronephros. Imunocoloração das pronephros permite a visualização de quão bem os túbulos pronephric foram alvejados. A sobre-expressão e efeitos de knockdown pode então ser marcado contra o lado contralateral do embrião, o qual serve como um controlo de desenvolvimento, e podem ser usados ​​para calcular o índice pronephric 13. A disponibilidade de mapas destino celular permite que esta técnica de microinjecção objectivo de ser utilizada para os tecidos alvo othER do que os pronephros, e a co-injecção de um traçador fluorescente permite a micro-injecção direccionada para cada tecido a ser verificada antes da análise. Durante a microinjeção de embriões, a temperatura de desenvolvimento deve ser regulamentado firmemente, dado que a taxa de desenvolvimento de Xenopus é altamente dependente dele 14. Os embriões devem ser incubados a temperaturas mais baixas (14 - 16 ° C) para as injecções de células-4- 8 e porque o tempo de desenvolvimento é abrandado. A 22 ° C, o tempo de desenvolvimento de uma fase (1 célula) a fase 3 (4 células) é de aproximadamente 2 horas, enquanto que o tempo de desenvolvimento de 16 ° C para a fase 3 é de aproximadamente 4 horas. Demora cerca de 15 minutos para ir de um embrião de 4 células para uma célula-8 (etapa 4) de embriões a 22 ° C, mas demora cerca de 30 minutos a 16 ° C. Do mesmo modo, a 22 ° C, leva apenas 30 minutos para um embrião de 8 células de progredir para uma célula embrionária 16 (etapa 5). Este tempo é aumentado para 45 minutos a 16 ° C. oguinte, que é útil para diminuir a taxa de desenvolvimento dos embriões para permitir tempo suficiente para injecções na fase de 8 células antes de os embriões progredir para a fase de 16 células. Além disso, as temperaturas de crescimento pode ser modulada para acelerar ou retardar o desenvolvimento embrionário até o rim foi totalmente desenvolvido. A epiderme de girino em estágio embriões de Xenopus é relativamente transparente, permitindo a fácil imagem dos pronephros em desenvolvimento sem dissecção ou compensação do tecido 15. Devido à relativa transparência de embriões de Xenopus, imagens de células vivas também é viável 16,17. Todo-mount imunocoloração para visualizar as pronephros é possível com anticorpos estabelecidos que rotulam o proximal, intermediário, distal e túbulos de ligação de fase 38 - 40 embriões que permitem a avaliação do desenvolvimento pronephric depois alvo de manipulação da expressão do gene em embriões de Xenopus 18-20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E737-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, 99%+</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>52-90-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP525-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Fridge II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>260009</td>
			<td>Benchtop incubator for embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gap43-RFP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1817</td>
			<td>Tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7&#34; Drummond replacement tubes</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/XL</td>
			<td>Microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>For breaking microinjection needle tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, heavy</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CAS 8042-47-5</td>
			<td>Oil for needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G monoject hypodermic needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881200508</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 micron polyester mesh</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>CMY-0800-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm x 45 mm screw thread vial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-339-25B</td>
			<td>For fixing, staining, and storing embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzocaine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>BE130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D mini rocker, model 135</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>57281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, New Zealand origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S227I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 3G8 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label proximal tubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 4A6 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21428</td>
			<td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cavity spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>105862500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A396-500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

O rim embrionário de Xenopus laevis (rã), os pronephros, consiste de uma única nefrónio, e pode ser usado como um modelo para a doença renal. Embriões de Xenopus são grandes, desenvolvem externamente, e pode ser facilmente manipulado por microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, mapas destino foram estabelecidas para embriões de Xenopus. microinjecção alvejado no blastï¿½ero indivíduo que irá, eventualmente, dar origem a um órgão ou tecido de interesse pode ser utilizado para sobre-expressar selectivamente ou derrubar a expressão do gene restrita dentro desta região, diminuição dos efeitos secundários no resto do embrião em desenvolvimento. Neste protocolo, descrevemos como utilizar estabelecidos mapas destino Xenopus para atingir o Xenopus rim em desenvolvimento (os pronephros), por microinjecção blastomere específico de embriões de células 8 4 e. A injecção de marcadores de linhagem permite a verificação de uma orientação mais precisa da injecção.Depois de embriões se desenvolveram para encenar 38-40, todo-mount imuno é usado para visualizar o desenvolvimento pronephric, ea contribuição de células-alvo para os pronephros pode ser avaliado. A mesma técnica pode ser adaptada para outros tipos de tecidos alvo para além dos pronephros.

Microinjeções de 4 e 8 células de embriões de Xenopus com MEM-RFP mRNA mostram diferentes níveis de segmentação para os pronephros. A Figura 4 mostra estágio 40 embriões com MEM-RFP padrões de expressão de mRNA corretas. Os embriões foram injectados na blastï¿½ero ventral esquerdo (Figura 4A), e classificadas para o padrão de expressão adequada de ARNm de MEM-RFP. Além de expressar MEM-RFP no sentido proximal, intermédio e dis...

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.1K visualizações.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

Vídeo: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Um Ensaio de Blot de Ponto de 5 mC Quantificando o Nï¿½el de Metilaï¿½o de ADN da Dediferenciaï¿½o de Condrocitos<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Avaliação de danos oxidativos nas células de superfície ocular/células-tronco do rato primário em resposta ao dano ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...