A hipóxia é um dos principais impulsionadores do desenvolvimento do câncer que induz instabilidade genômica e tumorigênese. Demonstramos um método para gerar hipóxia central em um câncer sólido in vitro baseado na tecnologia de bioimpressão 3D. Usando este método, um gradiente hipoxic de rádio pode ser reproduzido usando uma estratégia simples que combina uma barreira permeável a gás impresso em 3D e uma tampa de vidro.
Esta tecnologia de câncer hipóxico em um chip pode ser usada para prever a eficácia da droga para facilitar a prescrição específica de medicamentos anticancerígenos do paciente. E espera-se também que permita um diagnóstico rápido de cânceres agressivos. Para auxiliar na preparação de uma solução de pré-gel de colágeno neutralizado de três mililitros, corte 30 miligramas de esponjas de colágeno em pedaços quadrados de cinco por cinco milímetros.
Coloque as peças em um frasco de vidro estéril de 10 mililitros e adicione 2,4 mililitros de 0,2 minga filtro 0,1 ácido clorídrico normal ao frasco para uma incubação de três dias a quatro graus Celsius e 15 revoluções por minuto. Após a digestão, coe qualquer partígena de colágeno não digerida através de um coador de células de 40 mícrons e armazene a solução de colágeno ácido a quatro graus Celsius por até sete dias. Para ajustar o pH da solução pré-gel de colágeno neutralizado de 1%, adicionar 30 microliters de solução vermelha fenol a uma concentração final de 1%e 300 microliters de 10X PBS a uma concentração final de 10%Após a mistura e centrífugação, use um hidróxido de sódio normal para neutralizar o pH a sete, verificando a mudança de cor e adicionar água destilada para obter um volume total de três mililitros.
Em seguida, armazene a solução de pré-gel de colágeno ajustada de 1% a 1% a quatro graus Celsius para uso dentro de três dias. Para verificar a gelação da solução de pré-gel de colágeno neutralizado, use uma pipeta de deslocamento positiva para adicionar 50 microliters de gotículas de colágeno a um prato pequeno e incubar as gotículas em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora. No final da incubação, verifique se o colágeno mudou de uma cor transparente para um branco opaco.
Incline o recipiente para confirmar que o colágeno está aderindo ao fundo do recipiente. E despeje PBS na gota para confirmar que a construção do colágeno não quebra a solução. Para imprimir em 3D um molde PEVA sacrificial, clique em Arquivo e salvar o tipo de arquivo como STL para converter o arquivo CAD 3D em um arquivo STL e clique em Opção e formulário de saída como ASCII para gerar o código G.
Para importar o arquivo STL gerado, clique em Arquivo e abra o arquivo STL e selecione o arquivo STL salvo. Para gerar automaticamente o código G do molde PEVA sacrificial, selecione o modelo de fatia do trocador STL-CAD. Em seguida, para gerar caminhos de impressão para a fabricação do chip, use um bocal de precisão de 50 medidores a uma pressão pneumática de 500 quilopascals a 110 graus Celsius para imprimir o molde de PEVA sacrificial em um slide de histologia hidrofílica adesivo estéril.
Para lançar a barreira PDMS, misturou seis mililitros de elastômero base PDMS e 600 microliters de agente de cura por cinco minutos em um reservatório plástico e carregar a solução homogeneamente misturada em uma seringa descartável de 10 mililitros. Equipei a seringa com uma ponta de dispensa de distribuição de plástico de 20 bitolas e encha o molde de PEVA sacrificial com a solução PDMS combinada. O PDMS misturado encherá este molde de PEVA sacrificial com uma superfície convexa e a barreira será maior que a do molde.
Depois de curar a barreira PDMS em um forno de 40 graus Celsius por mais de 36 horas para evitar derreter o PEVA, use um par de pinças de precisão para desprender o molde de PEVA sacrificial e esterilizar a barreira permeável do gás a 120 graus Celsius em uma autoclave. Para misturar a solução com células cancerígenas, resuspenja cada tipo de pelota celular coletada em 20 microliters de meio de cultura e adicione um mililitro de solução pré-gel de colágeno neutralizado em cada uma das suspensões celulares resuspended em gelo molhado com mistura suave. Use uma pipeta de deslocamento positiva para misturar cada suspensão celular.
Quando forem obtidas soluções homogêneas, use uma pipeta descartável positiva para transferir os bioinks de colágeno encapsulados para três seringas descartáveis mililitros e armazene as seringas a quatro graus Celsius até a impressão celular 3D. Para impressão 3D de anéis concêntricos de câncer- stroma, converta o arquivo 3D CAD apropriado em um formato de arquivo STL e use um trocador STL-CAD para gerar um código G dos anéis concêntricos de câncer. Carregue os bioinks de colágeno encapsulados da célula na cabeça da impressora 3D e coloque a temperatura da cabeça e da placa em 15 graus Celsius.
Carregue o caminho de impressão gerado no software de controle da impressora 3D e clique Em Iniciar a impressão dos bioinks de colágeno na barreira permeável do gás de acordo com o código G carregado com uma agulha de plástico calibre 18 a uma pressão pneumática de aproximadamente 20 quilopascals a 15 graus Celsius. No final de cada operação de impressão, coloque manualmente uma tampa de vidro esterilizada de 22 por 50 milímetros em cima da barreira permeável a gás para gerar o gradiente hipóxico. Depois de gerar três câncers hipóxicos em chips, transfira os chips para uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora para cruzar os bioinks de colágeno.
Quando todos os cânceres hipóxicos foram impressos, esfregou suavemente os óculos de cobertura em cima das barreiras permeáveis de gás com um raspador de células para uma ligação apertada. Para atualizar o meio de cultura celular para os chips sem separar a construção do câncer, incline os chips e use uma pipeta para introduzir 1,5 mililitros de meio de crescimento celular endotelial ao lado de cada chip. O câncer hipóxico foi projetado na forma de anéis concêntricos para imitar a difusão de oxigênio radial e o esgotamento observado nos tecidos cancerígenos.
Após definir o volume de controle de um espaço no qual o oxigênio é difundido e consumido pelas células, uma densidade celular apropriada para a geração de hipóxia central pode ser determinada através da análise de elementos finitos computacionais. Após a impressão celular 3D, uma estrutura de anel concêntrico compartimentalizada de câncer-stroma pode ser criada para reproduzir as características anatômicas do câncer sólido. Quantitativamente, a viabilidade celular pós-impressão é tipicamente maior que 96% confirmando que as condições de fabricação são apropriadas para câncer e células estromicas.
Nesta análise representativa, dois grupos foram comparados de acordo com a presença e ausência do gradiente de oxigênio para verificar os efeitos de um gradiente hipóxico na progressão do câncer. Em ambas as condições, as células endoteliais positivas de CD31 estavam presentes nas regiões periféricas, indicando que construtos vivos espacialmente padronizados foram produzidos utilizando tecnologia de bioimpressão 3D. Em comparação com a condição negativa do gradiente de oxigênio, a condição positiva do gradiente demonstrou um gradiente hipóxico, indicando a expressão gradual do HIF1 alfa.
Também foram observadas células pseudopalisaded positivas SHMT2 e células pluripotentes positivas SOX2 e células pluripotentes positivas SOX2, indicativo da presença de características fisiofisiológicas agressivas do câncer sólido. O câncer hipóxico on-a-chip é uma ferramenta útil para investigar as características fisiopatológicas dos cânceres sólidos e o crosstalk dinâmico entre células cancerígenas e tumorigênese promovendo o microambiente. Como a metodologia pode ser adaptada para um projeto de medicamentos específico do paciente em um prazo razoável, espera-se que essa abordagem altere a lacuna entre modelos in vivo e in vitro de câncer.
