Graças à Anseth Kristi laboratório da Universidade de Colorado, Boulder para generosamente fornecer MIN6 células. Financiamento para este projeto foi fornecido pela NSF.

1. PEGDM síntese e fotoativo PEGDM preparação da solução macrômero <ol><li> Pesar 2 g de PEG (linear, 10.000 Da) em um frasco de vidro 40mL com tampa de plástico duro. </li><li> Adicionar aproximadamente 308μL de anidrido metacrílico e vagamente tampa do frasco. </li><li> Microondas o frasco em alta por 2 minutos no microondas doméstico padrão. Uso de luvas resistentes ao calor, completamente vortex do frasco, em seguida, microondas em alta por mais 5 minutos. </li><li> Brevemente permitir que o frasco para resfriar o suficiente para ser manuseado com luvas. Uncap-lo e adicionar lentamente o cloreto de metileno enquanto agita o frasco. Adicionar o suficiente para que a solução aparece clara e homogênea, vórtex da amostra, conforme necessário. O volume total de cloreto de metileno usado deve ser 1,5-2 mL. </li><li> PEGDM precipitado em 200 mL de frio, agitado éter etílico, adicionando a solução gota a gota. </li><li> Recolher o PEGDM por filtração a vácuo e deixe-a secar. </li><li> Dissolver o PEGDM em uma quantidade adequadade água deionizada (tipicamente 100 -150 mL). </li><li> A solução diálise contra água deionizada por 5 dias em tubo de diálise com um peso molecular de corte de 1.000 Da. Substitua a água uma vez por dia. </li><li> Alíquota da solução em recipientes adequados e congelar a -80 ° C durante a noite. Lyophilize a solução para quatro dias para produzir um pó purificado PEGDM branco. Armazenar o pó a 4 ° C quando não estiver em uso. </li><li> Para preparar uma solução PEGDM fotoativo, primeiro prepare um peso 0,5 por cento solução estoque, dissolvendo fotoiniciador IRGACURE 2959 em água deionizada. Vortex da solução e armazená-lo no escuro. </li><li> Prepare a 10% em peso PEGDM e 0,025% em peso IRGACURE 2959 solução em solução salina balanceada de Hank (HBSS). Vortex cuidadosamente para garantir a dissolução da PEGDM. Normalmente, preparar 1mL desta solução de cada vez. </li><li> Esterilizar a solução filtrando-a através de um filtro de seringa de 0,2 m em um tubo de microcentrífuga 1,8 mL. Enrole o tubo em papel alumínioe armazenar a 4 ° C </li></ol> 2. Cultura, infecção, e agregação de células MIN6 <ol><li> MIN6 células são cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, glicose 7mm, 100 unidades / mL de penicilina / estreptomicina e 0,5 mcg / mL amphotercin B em um ambiente umidificado a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Para liberar as células da superfície tratada cultura frasco, aspire o meio, lavar as células com 37 ° C de cálcio / magnésio livre de HBSS, aspirar o HBSS, em seguida, adicione 2 mL da solução 37 ° C tripsina-EDTA e permitir que as células incubar por 3 minutos. </li><li> Jar firmemente do lado do frasco para bater as células livres, em seguida, adicione 8 mL de 37 ° C médio e vigorosamente pipeta suspensão de células cima e para baixo com cuidado para não introduzir bolhas. </li><li> Pipeta as células em um tubo de centrifugação estéril 15 mL e realizar uma contagem de células usando um hemocitômetro ou outra célula contagem procedimento. </li><li> Na preparação para infectar as células com o fabricantevírus, primeiro determine o número total de células a serem infectadas e calcular o volume de suspensão de vírus necessários para atingir a multiplicidade desejado de infecção (MOI) (50 a 100 partículas infecciosas por célula). </li><li> Diluir o vírus em HBSS com cuidado pipetar a quantidade adequada de suspensão de vírus em um volume pré-alíquotas de HBSS em um tubo de microcentrífuga de 1,8 mL. 50 mL de HBSS por poço de células agregando é apropriado. </li><li> Dispersar as células por pipetagem-los cima e para baixo em seu tubo, em seguida, pipetar o volume necessário para atingir 400 mil células por poço em poços de uma placa de cultura de 6 bem suspensão. </li><li> Adicionar o volume apropriado de vírus diluído em cada poço para alcançar o desejado MOI. </li><li> Adicionar média a cada poço para trazer o volume total até 1,7 mL. </li><li> Coloque a placa em um agitador orbital no interior da incubadora. Definir o agitador em um nível baixo de modo que o meio lava delicadamente ao redor dos poços (~ 100 rpm). Permitir que as células a agregaçãote para 24-36 horas. Agregados com um diâmetro aproximado de 75-175 mM deve ser formado. </li></ol> 3. Encapsulamento de células em PEGDM <ol><li> Células podem ser encapsulados como uma dispersão (passo 2.4) ou agregação seguinte (passo 2.10). Desde o hidrogel solução PEGDM precursor é um líquido, as células tendem a resolver antes de reticulação e formação de hidrogel. Se a liquidação está prevista para ocorrer rapidamente, como com os agregados maiores, ela pode ser benéfica para produzir o hidrogel em duas etapas para que as células liquidar a um plano central do gel. A um passo procedimento de síntese de hidrogel apropriada para células dispersas é mostrada (Figura 2) e do procedimento em duas etapas também é mostrado (Figura 3) e detalhado abaixo (3,2-3,9). </li><li> Criar uma embarcação em que o hidrogel será formado por cortar a ponta afilada fora de uma seringa de 1 mL de plástico e colocá-lo aberto acabar em um rack. </li><li> Pipete 20 de PEGDM fotoativo assimlução na extremidade aberta da seringa para o êmbolo certificando-se o volume de cobre a superfície de êmbolo inteiro. Ajustar o êmbolo em pequenos incrementos para alcançar uma superfície plana de fluido. </li><li> Coloque a pipeta no rack e posição do rack debaixo de uma lâmpada UV (365nm, ~ 7 mW / cm 2) por aproximadamente 8 minutos para permitir crosslinking hidrogel. Durante este tempo, a preparação das células pode ser iniciada </li><li> Volume de uma pipeta contendo o número desejado de células / agregados em um tubo de microcentrífuga 1,8 mL tampão, e centrifugar o tubo a 130 g por 5 minutos. </li><li> Usando uma micropipeta, remova cuidadosamente os meios de comunicação, sem perturbar o pellet celular na ponta do tubo. Como a cabeça media se aproxima do pellet, pode ser útil usar um mais fino, 10 mL ponta da pipeta. </li><li> Delicadamente ressuspender o pellet celular em 20 mL de solução fotoativo PEGDM (use a ponta da pipeta de boca larga, se trabalhar com agregados) e adicione a suspensão de células para a seringa em cima do diae anteriormente reticulado parte hidrogel. </li><li> Expor a seringa a um adicional de 8 minutos de luz UV para completar a construção do hidrogel. Quando terminar, as células devem ser totalmente encapsulados dentro do hidrogel cilíndrico (Figura 3). </li><li> Ejetar o hidrogel da seringa e em 1 mL de HBSS no poço de uma placa de 24 poços brevemente lavar o gel. Transferir o gel para 1 mL da mídia no poço de uma placa de 24 poços e da cultura nas condições desejadas. </li></ol> 4. Rastreamento de hipóxia <ol><li> Em qualquer ponto durante a cultura da imagem, as células por microscopia de fluorescência para acompanhar o início da sinalização hipóxica. Dependendo do que está sendo fotografada você pode imagem na placa multi-bem ou transferir o gel para uma lâmina de microscópio antes da colocação no palco microscópio. Pico de excitação Ds Vermelho é alcançado a 556nm e de emissão de pico ocorre em 586nm. Emissão é bastante intensa e, portanto, fotodegradação não foi observáveled a ser problemático. Intervalo de tempo entre o início da produção de proteínas e detecção primeiro sinal é de aproximadamente 12 horas. Sinal é específico o suficiente para identificar as células individuais de sinalização, mas a resolução pode ser inadequado para determinar a localização do sinal intracelular. Em células de sinalização, o sinal é tipicamente observada uniformemente por todo o citoplasma. Intensidade do sinal também pode aumentar com a exposição prolongada à hipóxia, embora ainda não totalmente determinado, se isto é devido ao aumento da expressão da proteína, o acúmulo de proteína total, proteína ou maturação atrasada. </li></ol> 5. Resultados representativos Um exemplo representativo de MIN6 agregados encapsulados em um hidrogel PEG é mostrado na Figura 4. O gel reticulado será sólida por toda parte, tomando a forma do navio em que a reação foi realizada. Um gel com superfícies lisas exterior é preferível para o implante para auxiliar na prevenção de uma re corpo estranhosponse. Dentro do gel, agregados celulares deve ser totalmente fechado na matriz e homogeneamente distribuída para permitir a melhoria do transporte de nutrientes. Imagens representativas de sinalização hipóxica em MIN6 agregados são apresentados na Figura 5. Idêntica MIN6 agregados infectados com o vírus marcador foram cultivadas em ambos os 20% O 2 (5-A) ou 1% O 2 (5-B) por 44 horas antes da captura da imagem. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática da atividade do nosso sistema de marcador de hipóxia. Inserção adenoviral do gene DR Red Ds e promotor a montante HRE permite induzida por hipóxia produção da proteína fluorescente sob o controle do HIF-1. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxograma processual para o encapsulamento de uma etapa de dispersão MIN6 células em uma crosslinked hidrogel PEGDM. Para cada gel, as células dispersas são suspensas em 40μL da solução macrômero fotoativo PEGDM. Este é colocado em uma seringa de 1ml e decapitado o hidrogel é formado sob luz UV 365 nm, após 10-12 minutos. Após a conclusão, o disco de hidrogel é removido da seringa, lavados e colocados em uma placa de médio encheu bem para incubação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" /> Figura 3. Fluxograma processual para o encapsulamento dual-passo de agregados MIN6 células em um hidrogel reticulado PEGDM. Para cada gel, gel-meia é o primeiro formado por reticulação UV de 20μL da solução macrômero fotoativo PEGDM por 8 minutos. MIN6 agregados são cuidadosamente suspensas em uma solução de 20μL adicional de fotoativo macrômero que é adicionado no topo do pré-formada meia-gel. O gel completo é formado por um adicional de 8 minutos de exposição UV com agregados totalmente encapsulado no medialplano do gel. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem de um hidrogel 40μL em 20X ampliação. MIN6 agregados (~ 400.000 células total) são claramente vistos dentro do gel. Hidrogel diâmetro é de cerca de 6mm (bar = 1 mm). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" /> Figura 5. Hipóxia Fluorescente sinalização em agregados MIN6 células em um hidrogel PEGDM. Células que foram encapsulados e, em seguida, colocado em incubação a 20% O 2 por 44 horas não apresentam sinalização hipóxia (a), enquanto as células que foram encapsulados, em seguida, incubadas em 2% O 2 por 44 horas exibição de sinal, claro onipresente. (Barra = 100μm) (b).

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado oferece uma técnica rápida e simples para encapsulamento de células em um hidrogel PEG com uso mínimo de condições não fisiológicas. PEG representa um material de encapsulação muito útil para a sua biocompatibilidade e facilidade de modificação. Simples variação de porcentagem de PEG na solução fotoativo, por exemplo, pode ser usado para ajustar as propriedades mecânicas, como módulo de compressão, e propriedades de transporte através do tamanho dos poros. Além disso, PEG é facilmente modificado pela adição de cadeias laterais. Hidrogéis PEG, portanto, representar tanto um dispositivo promissor clínica e uma plataforma flexível para investigação in vitro Um método para rastreamento de hipóxia em PEG-encapsulado células também tem sido apresentado. Este método é útil para a simplicidade da detecção de hipóxia e para evitar a necessidade de sacrificar as células de interesse. A técnica pode ser aplicada a uma variedade de tipos de células em uma variedade de condições de fazer a sua nosefulness amplo. Por exemplo, a hipóxia como uma dica para a diferenciação de células-tronco podem ser controladas em culturas de células-tronco Micromass. No entanto, este método só pode ser aplicada para dispersar sistemas de célula ou sistema no qual as células são dispersos depois agregadas. Além disso, a detecção do sinal fluorescente pode ser difícil em tecidos maiores ou mais densas.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 309028-500G </td><td></td></tr><tr><td> Anidrido metacrílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276685-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Microonda </td><td> Emerson </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries </td><td> SI-A236 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de metileno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D65100-1L </td><td></td></tr><tr><td> Éter etílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 346136-1L </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação de diálise </td><td> Espectro </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Laboratórios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Congelador </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Liofilizador </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Ludibriar </td><td> 8917Z-01 </td><td></td></tr><tr><td> IRGACURE 2959 </td><td> Ciba-Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de seringa </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * Formulação personalizada </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-351 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Anfotericina B </td><td> Mediatech </td><td> 30-003-CF </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3597 </td><td> Napco Series 8000 WJ supressão w / O2 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-052-CI </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada UV </td><td> Sanyo Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> Detém dois 40W, 365nm blacklight lâmpadas UV azul </td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * Número de ordem. Modelo 5810 R </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td> TI-ND6-PFS </td><td> Com filterset para excitação 556nm / 586nm de emissão </td></tr></table>

tracking hypoxic signaling within encapsulated cell aggregates

Em Diabetes mellitus tipo 1, a destruição auto-imune do pâncreas β-células resulta em perda de produção de insulina e hiperglicemia potencialmente letal. Como uma alternativa ao tratamento com injeção de insulina exógena, o transplante de tecido pancreático funcional tem sido explorado 1,2. Esta abordagem oferece a promessa de uma forma mais natural, a restauração a longo prazo de normoglicemia. Proteção do tecido do doador a partir do sistema imune do hospedeiro é necessário para evitar a rejeição e encapsulamento é um método usado para ajudar a atingir este objectivo. Materiais biologicamente derivados, como o alginato de agarose 3 e 4, têm sido a escolha tradicional para a construção da cápsula, mas pode induzir inflamação ou fibrose overgrowth 5, que podem impedir o transporte de nutrientes e oxigênio. Alternativamente, sintético poli (etileno glicol) (PEG) com base em hidrogéis são não-degradante, facilmente funcionalizados, disponível em alta pureza,têm tamanho dos poros controlável, e são extremamente biocompatível, 6,7,8. Como um benefício adicional, hidrogéis PEG pode ser formado rapidamente em uma reação de reticulação foto simples que não requer a aplicação de não-fisiológicos temperaturas 6,7. Tal procedimento é descrito aqui. Na reação de reticulação, degradação UV do fotoiniciador, 1 - [4 - (2-hidroxietoxi)-fenil]-2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-one (IRGACURE 2959), produz radicais livres que atacam o vinil ligações carbono-carbono dupla de dimethacrylated crosslinking induzindo PEG (PEGDM) na cadeia termina. Reticulação pode ser alcançado em 10 minutos. Hidrogéis PEG construída de tal forma têm se mostrado favoráveis ​​de células 7,9, ea concentração fotoiniciador baixa e uma breve exposição à radiação UV não é prejudicial à viabilidade e função do tecido encapsulado 10. Enquanto nós metacrilato nosso PEG com o método descrito abaixo, PEGDM também pode ser dirrectamente comprado de fornecedores como a Sigma. Uma conseqüência do encapsulamento é o isolamento das células de uma rede vascular. Fornecimento de nutrientes, nomeadamente de oxigênio, é reduzida e limitada por difusão. Esta disponibilidade de oxigênio reduzida pode especialmente impacto β-células, cuja função secretora de insulina é altamente dependente de oxigênio 11-13. Composição da cápsula e geometria também terá impacto taxas de difusão e comprimentos de oxigênio. Portanto, nós também descrevem uma técnica para identificar as células hipóxicas dentro de cápsulas nosso PEG. Infecção das células com um adenovírus recombinante permite um sinal fluorescente a ser produzido quando intracelular fator induzível por hipóxia (HIF) vias são ativadas 14. Como HIFs são os principais reguladores da resposta transcricional a hipóxia, eles representam um marcador de alvo ideal para a detecção de hipóxia sinalização 15. Esta abordagem permite a detecção mais fácil e rápida de hypoxic células. Resumidamente, o adenovírus tem a seqüência de uma proteína fluorescente vermelha (Red Ds DR de Clontech) sob o controle de um elemento de hipóxia-responsivos (HRE) trímero. Estabilização do HIF-1 por condições de baixo oxigênio irá conduzir a transcrição da proteína fluorescente (Figura 1). Detalhes adicionais sobre a construção desse vírus têm sido publicados anteriormente 15. O vírus é armazenado em glicerol 10% a -80 ° C como muitos 150 mL alíquotas em 1,5 mL tubos de centrífuga em uma concentração de 3,4 x 10 10 PFU / mL. Estudos anteriores em nosso laboratório mostraram que MIN6 células encapsuladas como agregados manter a sua viabilidade ao longo de 4 semanas de cultura em 20% de oxigênio. MIN6 agregados cultivadas em 2 ou 1% de oxigênio mostrou dois sinais de células necróticas (ainda cerca de 85-90% viável) através da coloração com brometo de etídio, bem como alterações morfológicas em relação às células de oxigênio 20%. A forma lisa esférica dos agregados exibido em 20% foi lost e agregados apareceu mais como grupos desorganizados de células. Enquanto a tensão de oxigênio não causar uma queda acentuada da viabilidade, é claramente impactando MIN6 agregação e funcionar como medida pela glicose estimulada a secreção de insulina 15. Ocidental blot de células encapsuladas em 20% e 1% de oxigênio também mostrou um aumento significativo na HIF-1α em células cultivadas em condições de baixo oxigênio que se correlaciona com a expressão da proteína DsRed DR.

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Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

Um método para a foto de encapsulamento de células em um hidrogel reticulado PEG é descrito. Sinalização hipóxico dentro insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados é monitorado usando um sistema de marcador fluorescente. Este sistema permite o exame de série de células dentro de um hidrogel andaime e correlação de sinalização hipóxico com as mudanças no fenótipo celular.

Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.5K visualizações.  University of South Carolina. Um método para a foto de encapsulamento de células em um hidrogel reticulado PEG é descrito. Sinalização hipóxico dentro insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados é monitorado usando um sistema de marcador fluorescente. Este sistema permite o exame de série de células dentro de um hidrogel andaime e correlação de sinalização hipóxico com as mudanças no fenótipo celular.