Graças à Anseth Kristi laboratório da Universidade de Colorado, Boulder para generosamente fornecer MIN6 células. Financiamento para este projeto foi fornecido pela NSF.

1. PEGDM síntese e fotoativo PEGDM preparação da solução macrômero <ol><li> Pesar 2 g de PEG (linear, 10.000 Da) em um frasco de vidro 40mL com tampa de plástico duro. </li><li> Adicionar aproximadamente 308μL de anidrido metacrílico e vagamente tampa do frasco. </li><li> Microondas o frasco em alta por 2 minutos no microondas doméstico padrão. Uso de luvas resistentes ao calor, completamente vortex do frasco, em seguida, microondas em alta por mais 5 minutos. </li><li> Brevemente permitir que o frasco para resfriar o suficiente para ser manuseado com luvas. Uncap-lo e adicionar lentamente o cloreto de metileno enquanto agita o frasco. Adicionar o suficiente para que a solução aparece clara e homogênea, vórtex da amostra, conforme necessário. O volume total de cloreto de metileno usado deve ser 1,5-2 mL. </li><li> PEGDM precipitado em 200 mL de frio, agitado éter etílico, adicionando a solução gota a gota. </li><li> Recolher o PEGDM por filtração a vácuo e deixe-a secar. </li><li> Dissolver o PEGDM em uma quantidade adequadade água deionizada (tipicamente 100 -150 mL). </li><li> A solução diálise contra água deionizada por 5 dias em tubo de diálise com um peso molecular de corte de 1.000 Da. Substitua a água uma vez por dia. </li><li> Alíquota da solução em recipientes adequados e congelar a -80 ° C durante a noite. Lyophilize a solução para quatro dias para produzir um pó purificado PEGDM branco. Armazenar o pó a 4 ° C quando não estiver em uso. </li><li> Para preparar uma solução PEGDM fotoativo, primeiro prepare um peso 0,5 por cento solução estoque, dissolvendo fotoiniciador IRGACURE 2959 em água deionizada. Vortex da solução e armazená-lo no escuro. </li><li> Prepare a 10% em peso PEGDM e 0,025% em peso IRGACURE 2959 solução em solução salina balanceada de Hank (HBSS). Vortex cuidadosamente para garantir a dissolução da PEGDM. Normalmente, preparar 1mL desta solução de cada vez. </li><li> Esterilizar a solução filtrando-a através de um filtro de seringa de 0,2 m em um tubo de microcentrífuga 1,8 mL. Enrole o tubo em papel alumínioe armazenar a 4 ° C </li></ol> 2. Cultura, infecção, e agregação de células MIN6 <ol><li> MIN6 células são cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, glicose 7mm, 100 unidades / mL de penicilina / estreptomicina e 0,5 mcg / mL amphotercin B em um ambiente umidificado a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Para liberar as células da superfície tratada cultura frasco, aspire o meio, lavar as células com 37 ° C de cálcio / magnésio livre de HBSS, aspirar o HBSS, em seguida, adicione 2 mL da solução 37 ° C tripsina-EDTA e permitir que as células incubar por 3 minutos. </li><li> Jar firmemente do lado do frasco para bater as células livres, em seguida, adicione 8 mL de 37 ° C médio e vigorosamente pipeta suspensão de células cima e para baixo com cuidado para não introduzir bolhas. </li><li> Pipeta as células em um tubo de centrifugação estéril 15 mL e realizar uma contagem de células usando um hemocitômetro ou outra célula contagem procedimento. </li><li> Na preparação para infectar as células com o fabricantevírus, primeiro determine o número total de células a serem infectadas e calcular o volume de suspensão de vírus necessários para atingir a multiplicidade desejado de infecção (MOI) (50 a 100 partículas infecciosas por célula). </li><li> Diluir o vírus em HBSS com cuidado pipetar a quantidade adequada de suspensão de vírus em um volume pré-alíquotas de HBSS em um tubo de microcentrífuga de 1,8 mL. 50 mL de HBSS por poço de células agregando é apropriado. </li><li> Dispersar as células por pipetagem-los cima e para baixo em seu tubo, em seguida, pipetar o volume necessário para atingir 400 mil células por poço em poços de uma placa de cultura de 6 bem suspensão. </li><li> Adicionar o volume apropriado de vírus diluído em cada poço para alcançar o desejado MOI. </li><li> Adicionar média a cada poço para trazer o volume total até 1,7 mL. </li><li> Coloque a placa em um agitador orbital no interior da incubadora. Definir o agitador em um nível baixo de modo que o meio lava delicadamente ao redor dos poços (~ 100 rpm). Permitir que as células a agregaçãote para 24-36 horas. Agregados com um diâmetro aproximado de 75-175 mM deve ser formado. </li></ol> 3. Encapsulamento de células em PEGDM <ol><li> Células podem ser encapsulados como uma dispersão (passo 2.4) ou agregação seguinte (passo 2.10). Desde o hidrogel solução PEGDM precursor é um líquido, as células tendem a resolver antes de reticulação e formação de hidrogel. Se a liquidação está prevista para ocorrer rapidamente, como com os agregados maiores, ela pode ser benéfica para produzir o hidrogel em duas etapas para que as células liquidar a um plano central do gel. A um passo procedimento de síntese de hidrogel apropriada para células dispersas é mostrada (Figura 2) e do procedimento em duas etapas também é mostrado (Figura 3) e detalhado abaixo (3,2-3,9). </li><li> Criar uma embarcação em que o hidrogel será formado por cortar a ponta afilada fora de uma seringa de 1 mL de plástico e colocá-lo aberto acabar em um rack. </li><li> Pipete 20 de PEGDM fotoativo assimlução na extremidade aberta da seringa para o êmbolo certificando-se o volume de cobre a superfície de êmbolo inteiro. Ajustar o êmbolo em pequenos incrementos para alcançar uma superfície plana de fluido. </li><li> Coloque a pipeta no rack e posição do rack debaixo de uma lâmpada UV (365nm, ~ 7 mW / cm 2) por aproximadamente 8 minutos para permitir crosslinking hidrogel. Durante este tempo, a preparação das células pode ser iniciada </li><li> Volume de uma pipeta contendo o número desejado de células / agregados em um tubo de microcentrífuga 1,8 mL tampão, e centrifugar o tubo a 130 g por 5 minutos. </li><li> Usando uma micropipeta, remova cuidadosamente os meios de comunicação, sem perturbar o pellet celular na ponta do tubo. Como a cabeça media se aproxima do pellet, pode ser útil usar um mais fino, 10 mL ponta da pipeta. </li><li> Delicadamente ressuspender o pellet celular em 20 mL de solução fotoativo PEGDM (use a ponta da pipeta de boca larga, se trabalhar com agregados) e adicione a suspensão de células para a seringa em cima do diae anteriormente reticulado parte hidrogel. </li><li> Expor a seringa a um adicional de 8 minutos de luz UV para completar a construção do hidrogel. Quando terminar, as células devem ser totalmente encapsulados dentro do hidrogel cilíndrico (Figura 3). </li><li> Ejetar o hidrogel da seringa e em 1 mL de HBSS no poço de uma placa de 24 poços brevemente lavar o gel. Transferir o gel para 1 mL da mídia no poço de uma placa de 24 poços e da cultura nas condições desejadas. </li></ol> 4. Rastreamento de hipóxia <ol><li> Em qualquer ponto durante a cultura da imagem, as células por microscopia de fluorescência para acompanhar o início da sinalização hipóxica. Dependendo do que está sendo fotografada você pode imagem na placa multi-bem ou transferir o gel para uma lâmina de microscópio antes da colocação no palco microscópio. Pico de excitação Ds Vermelho é alcançado a 556nm e de emissão de pico ocorre em 586nm. Emissão é bastante intensa e, portanto, fotodegradação não foi observáveled a ser problemático. Intervalo de tempo entre o início da produção de proteínas e detecção primeiro sinal é de aproximadamente 12 horas. Sinal é específico o suficiente para identificar as células individuais de sinalização, mas a resolução pode ser inadequado para determinar a localização do sinal intracelular. Em células de sinalização, o sinal é tipicamente observada uniformemente por todo o citoplasma. Intensidade do sinal também pode aumentar com a exposição prolongada à hipóxia, embora ainda não totalmente determinado, se isto é devido ao aumento da expressão da proteína, o acúmulo de proteína total, proteína ou maturação atrasada. </li></ol> 5. Resultados representativos Um exemplo representativo de MIN6 agregados encapsulados em um hidrogel PEG é mostrado na Figura 4. O gel reticulado será sólida por toda parte, tomando a forma do navio em que a reação foi realizada. Um gel com superfícies lisas exterior é preferível para o implante para auxiliar na prevenção de uma re corpo estranhosponse. Dentro do gel, agregados celulares deve ser totalmente fechado na matriz e homogeneamente distribuída para permitir a melhoria do transporte de nutrientes. Imagens representativas de sinalização hipóxica em MIN6 agregados são apresentados na Figura 5. Idêntica MIN6 agregados infectados com o vírus marcador foram cultivadas em ambos os 20% O 2 (5-A) ou 1% O 2 (5-B) por 44 horas antes da captura da imagem. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática da atividade do nosso sistema de marcador de hipóxia. Inserção adenoviral do gene DR Red Ds e promotor a montante HRE permite induzida por hipóxia produção da proteína fluorescente sob o controle do HIF-1. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxograma processual para o encapsulamento de uma etapa de dispersão MIN6 células em uma crosslinked hidrogel PEGDM. Para cada gel, as células dispersas são suspensas em 40μL da solução macrômero fotoativo PEGDM. Este é colocado em uma seringa de 1ml e decapitado o hidrogel é formado sob luz UV 365 nm, após 10-12 minutos. Após a conclusão, o disco de hidrogel é removido da seringa, lavados e colocados em uma placa de médio encheu bem para incubação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" /> Figura 3. Fluxograma processual para o encapsulamento dual-passo de agregados MIN6 células em um hidrogel reticulado PEGDM. Para cada gel, gel-meia é o primeiro formado por reticulação UV de 20μL da solução macrômero fotoativo PEGDM por 8 minutos. MIN6 agregados são cuidadosamente suspensas em uma solução de 20μL adicional de fotoativo macrômero que é adicionado no topo do pré-formada meia-gel. O gel completo é formado por um adicional de 8 minutos de exposição UV com agregados totalmente encapsulado no medialplano do gel. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem de um hidrogel 40μL em 20X ampliação. MIN6 agregados (~ 400.000 células total) são claramente vistos dentro do gel. Hidrogel diâmetro é de cerca de 6mm (bar = 1 mm). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" /> Figura 5. Hipóxia Fluorescente sinalização em agregados MIN6 células em um hidrogel PEGDM. Células que foram encapsulados e, em seguida, colocado em incubação a 20% O 2 por 44 horas não apresentam sinalização hipóxia (a), enquanto as células que foram encapsulados, em seguida, incubadas em 2% O 2 por 44 horas exibição de sinal, claro onipresente. (Barra = 100μm) (b).

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado oferece uma técnica rápida e simples para encapsulamento de células em um hidrogel PEG com uso mínimo de condições não fisiológicas. PEG representa um material de encapsulação muito útil para a sua biocompatibilidade e facilidade de modificação. Simples variação de porcentagem de PEG na solução fotoativo, por exemplo, pode ser usado para ajustar as propriedades mecânicas, como módulo de compressão, e propriedades de transporte através do tamanho dos poros. Além disso, PEG é facilmente modificado pela adição de cadeias laterais. Hidrogéis PEG, portanto, representar tanto um dispositivo promissor clínica e uma plataforma flexível para investigação in vitro Um método para rastreamento de hipóxia em PEG-encapsulado células também tem sido apresentado. Este método é útil para a simplicidade da detecção de hipóxia e para evitar a necessidade de sacrificar as células de interesse. A técnica pode ser aplicada a uma variedade de tipos de células em uma variedade de condições de fazer a sua nosefulness amplo. Por exemplo, a hipóxia como uma dica para a diferenciação de células-tronco podem ser controladas em culturas de células-tronco Micromass. No entanto, este método só pode ser aplicada para dispersar sistemas de célula ou sistema no qual as células são dispersos depois agregadas. Além disso, a detecção do sinal fluorescente pode ser difícil em tecidos maiores ou mais densas.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 309028-500G </td><td></td></tr><tr><td> Anidrido metacrílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276685-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Microonda </td><td> Emerson </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries </td><td> SI-A236 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de metileno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D65100-1L </td><td></td></tr><tr><td> Éter etílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 346136-1L </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação de diálise </td><td> Espectro </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Laboratórios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Congelador </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Liofilizador </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Ludibriar </td><td> 8917Z-01 </td><td></td></tr><tr><td> IRGACURE 2959 </td><td> Ciba-Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de seringa </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * Formulação personalizada </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-351 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Anfotericina B </td><td> Mediatech </td><td> 30-003-CF </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3597 </td><td> Napco Series 8000 WJ supressão w / O2 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-052-CI </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada UV </td><td> Sanyo Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> Detém dois 40W, 365nm blacklight lâmpadas UV azul </td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * Número de ordem. Modelo 5810 R </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td> TI-ND6-PFS </td><td> Com filterset para excitação 556nm / 586nm de emissão </td></tr></table>

tracking hypoxic signaling within encapsulated cell aggregates

Em Diabetes mellitus tipo 1, a destruição auto-imune do pâncreas β-células resulta em perda de produção de insulina e hiperglicemia potencialmente letal. Como uma alternativa ao tratamento com injeção de insulina exógena, o transplante de tecido pancreático funcional tem sido explorado 1,2. Esta abordagem oferece a promessa de uma forma mais natural, a restauração a longo prazo de normoglicemia. Proteção do tecido do doador a partir do sistema imune do hospedeiro é necessário para evitar a rejeição e encapsulamento é um método usado para ajudar a atingir este objectivo. Materiais biologicamente derivados, como o alginato de agarose 3 e 4, têm sido a escolha tradicional para a construção da cápsula, mas pode induzir inflamação ou fibrose overgrowth 5, que podem impedir o transporte de nutrientes e oxigênio. Alternativamente, sintético poli (etileno glicol) (PEG) com base em hidrogéis são não-degradante, facilmente funcionalizados, disponível em alta pureza,têm tamanho dos poros controlável, e são extremamente biocompatível, 6,7,8. Como um benefício adicional, hidrogéis PEG pode ser formado rapidamente em uma reação de reticulação foto simples que não requer a aplicação de não-fisiológicos temperaturas 6,7. Tal procedimento é descrito aqui. Na reação de reticulação, degradação UV do fotoiniciador, 1 - [4 - (2-hidroxietoxi)-fenil]-2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-one (IRGACURE 2959), produz radicais livres que atacam o vinil ligações carbono-carbono dupla de dimethacrylated crosslinking induzindo PEG (PEGDM) na cadeia termina. Reticulação pode ser alcançado em 10 minutos. Hidrogéis PEG construída de tal forma têm se mostrado favoráveis ​​de células 7,9, ea concentração fotoiniciador baixa e uma breve exposição à radiação UV não é prejudicial à viabilidade e função do tecido encapsulado 10. Enquanto nós metacrilato nosso PEG com o método descrito abaixo, PEGDM também pode ser dirrectamente comprado de fornecedores como a Sigma. Uma conseqüência do encapsulamento é o isolamento das células de uma rede vascular. Fornecimento de nutrientes, nomeadamente de oxigênio, é reduzida e limitada por difusão. Esta disponibilidade de oxigênio reduzida pode especialmente impacto β-células, cuja função secretora de insulina é altamente dependente de oxigênio 11-13. Composição da cápsula e geometria também terá impacto taxas de difusão e comprimentos de oxigênio. Portanto, nós também descrevem uma técnica para identificar as células hipóxicas dentro de cápsulas nosso PEG. Infecção das células com um adenovírus recombinante permite um sinal fluorescente a ser produzido quando intracelular fator induzível por hipóxia (HIF) vias são ativadas 14. Como HIFs são os principais reguladores da resposta transcricional a hipóxia, eles representam um marcador de alvo ideal para a detecção de hipóxia sinalização 15. Esta abordagem permite a detecção mais fácil e rápida de hypoxic células. Resumidamente, o adenovírus tem a seqüência de uma proteína fluorescente vermelha (Red Ds DR de Clontech) sob o controle de um elemento de hipóxia-responsivos (HRE) trímero. Estabilização do HIF-1 por condições de baixo oxigênio irá conduzir a transcrição da proteína fluorescente (Figura 1). Detalhes adicionais sobre a construção desse vírus têm sido publicados anteriormente 15. O vírus é armazenado em glicerol 10% a -80 ° C como muitos 150 mL alíquotas em 1,5 mL tubos de centrífuga em uma concentração de 3,4 x 10 10 PFU / mL. Estudos anteriores em nosso laboratório mostraram que MIN6 células encapsuladas como agregados manter a sua viabilidade ao longo de 4 semanas de cultura em 20% de oxigênio. MIN6 agregados cultivadas em 2 ou 1% de oxigênio mostrou dois sinais de células necróticas (ainda cerca de 85-90% viável) através da coloração com brometo de etídio, bem como alterações morfológicas em relação às células de oxigênio 20%. A forma lisa esférica dos agregados exibido em 20% foi lost e agregados apareceu mais como grupos desorganizados de células. Enquanto a tensão de oxigênio não causar uma queda acentuada da viabilidade, é claramente impactando MIN6 agregação e funcionar como medida pela glicose estimulada a secreção de insulina 15. Ocidental blot de células encapsuladas em 20% e 1% de oxigênio também mostrou um aumento significativo na HIF-1α em células cultivadas em condições de baixo oxigênio que se correlaciona com a expressão da proteína DsRed DR.

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Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

Um método para a foto de encapsulamento de células em um hidrogel reticulado PEG é descrito. Sinalização hipóxico dentro insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados é monitorado usando um sistema de marcador fluorescente. Este sistema permite o exame de série de células dentro de um hidrogel andaime e correlação de sinalização hipóxico com as mudanças no fenótipo celular.

Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.6K visualizações.  University of South Carolina. Um método para a foto de encapsulamento de células em um hidrogel reticulado PEG é descrito. Sinalização hipóxico dentro insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados é monitorado usando um sistema de marcador fluorescente. Este sistema permite o exame de série de células dentro de um hidrogel andaime e correlação de sinalização hipóxico com as mudanças no fenótipo celular.

Vídeo: Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Bioengenharia

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as cyclodextrin nanosponges (CDNSEDTA). Two different preparations are described with 1:4 and 1:8 CD-EDTA molar ratios. The corresponding cross-linked polymers were contacted with 0.27 M aqueous solution of ibuprofen sodium salt (IP) leading to homogeneous, colorless, drug loaded hydrogels.
The systems were characterized by high resolution magic angle spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy. Pulsed field gradient spin echo (PGSE) NMR spectroscopy was used to determine the mean square displacement (MSD) of IP inside the polymeric gel at different observation times td. The data were further processed in order to study the time dependence of MSD: MSD = f(td). The proposed methodology is useful to characterize the different diffusion regimes that, in principle, the solute may experience inside the hydrogel, namely normal or anomalous diffusion. The full protocols including the polymer preparation and purification, the obtainment of drug-loaded hydrogels, the NMR sample preparation, the measurement of MSD by HR-MAS NMR spectroscopy and the final data processing to achieve the time dependence of MSD are here reported and discussed. The presented experiments represent a paradigmatic case and the data are discussed in terms of innovative approach to the characterization of the transport properties of an encapsulated guest within a polymeric host of potential application for drug delivery.

The motion regimes of ibuprofen encapsulated in &#946;-cyclodextrin nanosponges polymer network are investigated using pulsed-field-gradient spin-echo (PGSE) NMR technique. Synthesis, purification, drug loading, implementation of the NMR pulse sequence and data analysis to work out the mean square displacement of the drug at several observation times are described in detail.

Propriedades de transporte de Ibuprofeno encapsulados em ciclodextrina nanoesponja hidrogéis: A Proton HR-MAS NMR Estudo Spectroscopy

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Montagem e Rastreamento do Desenvolvimento de Comunidade Microbiana em uma Plataforma Microwell Array

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...