Este método é usado para estudar receptores de cone que são essenciais para a visão diurna. A vantagem dos métodos é que ele usa ovos de galinha fertilizados, que são fáceis de acesso, e uma das únicas fontes de culturas primárias de cone. O protocolo foi usado para identificar o Fator de Viabilidade do Cone Derivado de Rod, um futuro tratamento promissor para a degeneração herdada da retina.
Além disso, o protocolo foi utilizado para estudar o metabolismo do fotorreceptor de cone. Seguindo cuidadosamente o protocolo descrito, um indivíduo cuja expertise está na cultura celular primária, deve ser capaz de obter a cultura enriquecida do cone após apenas algumas tentativas. Comece coletando ovos fertilizados semanalmente de um incubatório industrial.
Mantenha os óvulos fertilizados a 17 graus Celsius em laboratório. Para cada cultura, incubar sete ovos fertilizados durante 24 horas a 20 graus Celsius, e depois 136 horas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada com reversão intermitente de inclinação. Para recuperar os embriões de frango, lave a superfície dos ovos com desinfetante, quebre a casca de ovo fazendo um buraco no topo da casca com grandes alicates retos e, em seguida, corte a casca para remover o chapéu do ovo.
Extraia suavemente cada embrião da casca de ovo com fórceps curvos e transfira-o para uma placa de Petri contendo PBS estéril previamente aquecido a 37 graus Celsius. Remova cuidadosamente o envelope que envolve os embriões. Verifique o estágio de desenvolvimento de cada embrião por comparação visual com Hamburger e Hamilton e selecione dois embriões no 29º estágio de desenvolvimento Enuclear os olhos desses embriões selecionados e transferi-los para meio independente de dióxido de carbono.
Trabalhando em meio independente de dióxido de carbono, posicione quatro olhos com a córnea virada para baixo e o nervo óptico voltado para o experimentador. Faça um furo no nervo óptico usando dois fórceps retos. Insira um ramo de cada fórceps entre a retina e o epitélio pigmento, em seguida, puxe e gire o olho para desprender o epitélio da retina.
Remova a córnea, seguida pela lente e pelo vítreo. Transfira as quatro retinas para uma placa de Petri contendo o meio de Ringer em pH 7.2. Corte as quatro retinas em pedaços muito pequenos usando dois alicates retos e lave as peças duas vezes com o meio de Ringer.
Após a segunda lavagem, deixe os pedaços de retina caírem no fundo do tubo e remova a mídia. Trate as peças de retina com uma solução de Trippsin por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após 20 minutos, pare a reação adicionando mídia cultural complementada com soro de bezerro fetal 10% inativado.
Incubar a suspensão celular com 0,05 mg de DNase 1 Em seguida, dissociar imediatamente os aglomerados celulares e o DNA, pipetando para cima e para baixo com uma pipeta. Lave a suspensão da célula de retina duas vezes com meio de cultura quimicamente definido ou MDL. Trate duas placas pretas de cultura de 96 poços com um fundo transparente com polilise por duas horas a 37 graus Celsius.
Quando terminar, enxágue as placas duas vezes com meio de cultura M199. Adicione o azul Trypan a uma alíquota de 10 microliters da suspensão celular para manchar as células vivas. Em seguida, adicione a amostra de suspensão celular a um hemótmetro.
Após a contagem das células, leve a suspensão celular para as concentrações apropriadas usando MDL. Adicione 50 microliters da biblioteca de moléculas a serem rastreadas usando um padrão predefinido. Semear os 50 microliters das duas suspensões celulares nas duas placas de cultura pretas pré-tratadas de 96 poços.
Distribua as células nas placas com uma pipeta multicanal da direita da placa para a esquerda, homogeneizando entre cada coluna. Em seguida, incubar as placas por sete dias a 37 graus Celsius, sob 5% de dióxido de carbono sem alteração de mídia. Para contar as células viáveis, adicione 2,7 micromolars de calceina AM e 0,3 milimolar homodimer de etidium a cada poço da placa.
Incubar as placas por uma hora em temperatura ambiente na ausência de luz. Leia a fluorescência em um leitor de placas automatizada composto por um microscópio invertido equipado com uma lâmpada de mercúrio com dois filtros de excitação a 485 e 520 nanômetros, dois filtros de emissão a 520 e 635 nanômetros e uma câmera de dispositivo acoplada por carga. Este protocolo foi usado para tela de uma biblioteca cDNA normalizada feita de epitélio pigmentado coroide e retina de 400 olhos de uma criança de oito semanas, Long-Evans Rats.
Foram avaliados 2.112 conjuntos de 100 clones correspondentes a 211, 200 clones individuais. Entre as 42 piscinas de clones com razão superior a duas, as piscinas 0080 e 0073 apresentaram uma razão de viabilidade 16 e 14 vezes maior que o controle negativo após sete dias de cultura. Cada um selecionado de 100 clones foi subdividido em 16 conjuntos de 10 clones de seu estoque de glicerol.
A subloco 0073-09 deu a mais forte razão de viabilidade e foi subdividida para produzir 16 clones individuais que foram testados em uma terceira rodada de triagem em culturas enriquecidas com cone. O clone 0073-09-37 se destacou com uma razão de viabilidade de 2,5. Análises posteriores confirmaram que este clone tem um efeito robusto e reprodutível na sobrevivência do cone.
O teste foi repetido independentemente e a inserção de 1,8 quilobases foi sequenciada. Uma análise bioinformática revelou que o clone 0073-09-37, que foi chamado de Fator de Viabilidade do Cone Derivado do Epitélio, ou EdCVF contém três quadros de leitura abertos. Quando testado de forma independente, apenas o ORF1 exerceu um efeito protetor sobre os cones.
ORF1 foi produzido como uma proteína glutationa S-transferase. O fator de viabilidade do cone derivado do epitélio foi purificado e a tag GST foi removida. A análise da atividade trófica demonstrou que o EdCVF é capaz de prevenir a degeneração do cone no sistema de cultura enriquecido pelo cone.
Ao tentar este procedimento, o estágio de desenvolvimento dos embriões deve ser cuidadosamente verificado para obter as culturas enriquecidas com cone. Seguindo este protocolo, as células podem ser eletroporadas com DNA plasmídeo para estudar os mecanismos moleculares de quaisquer fatores de sobrevivência, como o RdCVF. Esta técnica pavimenta a pesquisa metabólica, incluindo o desenvolvimento de modelos matemáticos de sobrevivência de cone.
