This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience T&#252;bingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN T&#252;bingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).

Todos os procedimentos com animais foram realizados aderindo às diretrizes e leis para protecção dos animais determinados pelo Governo Federal alemão e aprovados pelo comitê de bem-estar animal institucional da Universidade de Tübingen. 1. Modelos Animais <ol><li> HR2.1: TN-XL Ca 2+ rato biosensor <ol><li> Use a HR2.1 transgênico: Linha do mouse TN-XL expressando o Ca 2+ biossensor TN-XL seletivamente em cones fotorreceptores 10. Use 3-6 semanas de idade ratos de ambos os sexos levantado com um 12 horas ritmo dia / noite padrão. </li></ol></li></ol> 2. Retinal Dissection <ol><li> Solução fisiológica <ol><li> Preparar de fresco de 2 L de solução extracelular, contendo NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1 mM, 1,25 mM NaH 2 PO 4, NaHCO 3 26 mM, 0,5 mM de L-glutamina, e 20 mM de (+) glicose. Misturar até dissolver todos os ingredientes. </li><li> Solução extracelular &quot;Bubble&quot;com carboxygen (95% de O2, 5% CO2) durante 5-10 min. Adicionar CaCl2 para atingir uma concentração de 2 mM. </li><li> Depois borbulhando a solução extracelular, medir o seu pH. O pH deve ser 7,4, de outra forma, é provável que foram cometidos erros durante a preparação da solução. Mantenha a taxa de borbulhamento e temperatura constante durante todo solução experimento para assegurar o pH constante. </li><li> Separe o estoque em dois frascos, um para dissecção retina e um para a configuração de gravação (perfusão). </li></ol></li><li> Enucleação do olho e isolamento de retina (5-10 min) <ol><li> Manter uma iluminação vermelha fraca na área de trabalho para enucleação. Use LEDs com um comprimento de onda máximo de 650 nm (ou mais) para evitar o branqueamento de cones durante a dissecção. </li><li> Dark-se adaptar o mouse durante 2 horas, colocando sua gaiola em um local bem ventilado, caixa à prova de luz para garantir que os cones são totalmente sensibilizado em vez de gravações. </li><li> Anestesiar o mouse sob um laboratóry capa com isoflurano (5%), utilizando um vaporizador e um recipiente estanque ao gás que contém uma gaiola de rato padrão. Siga cuidadosamente as instruções do fabricante ao manusear o vaporizador. Use luvas e máscara facial para reduzir a exposição aos alérgenos. </li><li> Use um microscópio binocular com um 10 - aumento de 40 vezes para dissecção. </li><li> Sacrifique o rato anestesiado por decapitação. </li><li> Para orientação, marcar a parte superior de cada olho (= dorsal) com uma caneta à prova d&#39;água. Mantenha o controle sobre se usando olho esquerdo ou direito. </li><li> Remover o olho usando cuidadosamente tesoura curva, cortando o nervo óptico por trás do globo ocular. Para dissecção, transferir o globo ocular de uma placa de Petri contendo solução extracelular recém carboxygenated. Para transferir o globo ocular, segure-o pela coto do nervo óptico. </li><li> Perfurar o olho em qualquer ponto ao longo da fronteira entre a córnea e a esclerótica (isto é, na ora serrata) com uma agulha de injecção afiada. </li><li> Segure o eYE na esclerótica com um par de pinças e suavemente inserir uma lâmina tesoura no furo feito na etapa anterior. Corte ao longo da ora serrata para separar a parte anterior do olho (córnea, cristalino, humor vítreo) a partir da parte posterior (ocular). Cortar a ocular radialmente (em relação ao disco óptico) com a posição da marca de caneta para indicar a posição dorsal sobre a retina. Nota: Preparado dessa forma, as viseiras podem ser mantidos em solução constantemente carboxygenated para uso posterior. </li><li> Gire a ocular na placa de Petri de tal forma que o dorsal cortar pontos longe de si mesmo. Agarrar a esclerótica no lado esquerdo e o lado direito da ocular com um par de pinças, inserindo cada uma das pontas fórceps entre retina e esclera. </li><li> Descolar a retina, invertendo suavemente a parte escleral da ocular. Finalmente, o corte do nervo óptico utilizando micro tesouras de dissecação para libertar a retina a partir da esclera. Nota: Esta é uma etapa crítica. Evitar danos na retina (por exemplo, pelatocar e apertando-o com fórceps). </li><li> Segurar uma das bordas da retina com um par de pinças e suavemente remover detritos e do corpo vítreo a partir da superfície da retina, através de um segundo par de fórceps. Quando a superfície da retina é limpo, use micro dissecação tesoura para fazer três mais curtos, cortes radiais adicionais (aproximadamente a cada 90 °). Estes cortes permitem achatar cuidadosamente a retina com o lado voltado para baixo de fotorreceptores na caixa de Petri (Figura 1A). </li></ol></li><li> Preparação fatia (10 - 15 min) <ol><li> Prepare de antemão membranas filtrantes de nitrocelulose para retinianas de corte e de vidro capa-deslizes para a montagem fatias e transferi-las para a câmara de gravação. Corte membrana de filtro de nitrocelulose em aproximadamente 10 x 5 milímetros pedaços retangulares de tamanho usando uma tesoura. Cortar lamelas em pedaços rectangulares de aproximadamente 10 x 5 milímetros de tamanho, utilizando uma glasscutter. </li><li> Lentamente, mergulhe uma lâmina de vidro na solução extracelular pertotecido. Gentilmente, puxar a retina para a lâmina de vidro com o lado da célula ganglionar-se, agarrando-o bem na borda usando um par de fórceps. Este processo reduz danos mecânicos e dobragem de tecido. </li><li> Escolha da região da retina que está relacionada com a respectiva questão de pesquisa (ver também a discussão). Lembre-se, a longo corte feito na etapa 2.2.9 marca a metade da retina dorsal (Figura 1A). Cortar uma, cerca de 1 x 2 milímetros pedaço rectangular de tamanho para fora da região da retina seleccionada usando uma lâmina de bisturi curvo. Limpe o excesso de solução em torno do tecido. </li><li> Coloque a membrana de filtro na parte superior da peça de retina de modo a que o lado das células do gânglio adere à membrana. Imediatamente, adicionar uma gota de meio extracelular na membrana para prender firmemente o tecido para a membrana. </li><li> Transferir o tecido da retina montada na membrana para a câmara de corte contendo solução extracelular fresco. </li><li> Cortar retina em fatias verticais de 200 uMespessura (Figura 1B), utilizando uma lâmina de barbear fresco ligada a um cortador de tecido 23. Mudar lâmina para cada peça da retina. Nota: A lâmina tem de ser perfeitamente alinhado com a superfície do fundo da câmara de corte de tal modo que toda a membrana divide simultaneamente, tal como indicado por um &quot;clique&quot; som ao cortar - caso contrário a lâmina pode dobrar e danificar a fatia. </li><li> Cole uma fatia montado na membrana única em uma tampa de deslizamento de vidro através da aplicação de alta graxa de vácuo para a membrana só termina (Figura 1C). Mantenha a superfície de vidro abaixo da retina sem gordura. </li><li> Mantenha-fatias montado lamela cobertos por uma gota de solução extracelular na câmara de retenção - um recipiente fechado e à prova de luz, por exemplo, um prato de Petri com a tampa coberta com folha de alumínio - sob uma atmosfera de carboxygen à TA. Introduzir carboxygen borbulhando um pequeno reservatório de água para manter a atmosfera na exploraçãocâmara úmida; isto evita que as fatias de secar. </li><li> Permitir fatias para descansar na câmara de retenção de 10 - 15 minutos antes de movê-los (um a um), para a câmara de registo. As fatias podem ser mantidas até 4-5 horas na câmara de retenção à TA (~ 21 ° C). </li></ol></li></ol> 3. Dois fótons Ca 2+ Imagiologia <ol><li> Microscopia de dois fótons <ol><li> Use um microscópio Objetivo Movable (MOM) -tipo de dois fótons microscópio. Ambos os procedimentos de projeto e de imagem MOM foram descritos anteriormente 24, para mais detalhes veja também 10,21,25 (por fontes e empresas, ver Tabela 1). Nota: Qualquer microscópio de dois fotões vertical que cumpre os seguintes requisitos mínimos podem ser usados: Tem que ser equipada com (a) um laser pulsado ajustável para ~ 860 nm, (b) um mínimo de dois canais de fluorescência adquiridos em simultâneo, (c ) Filtros para ECFP e citrino fluorescência, (d)um estimulador de luz (para possíveis projetos, ver 24,26), e (e) um software que permite gravar seqüências de imagens em tempo decorrido em uma taxa de quadros suficientes para resolver o Ca 2+ sinais de interesse. </li><li> Iniciar o sistema de imagem de dois fotões, tal como indicado pelo fabricante. Siga rigorosamente as diretrizes de segurança a laser da instalação. Comece a laser e ajustá-lo para ~ 860 nm. </li><li> Transferir uma fatia da câmara de retenção para a câmara de gravação e começar imediatamente a perfusão com solução extracelular carboxygenated. Manter uma taxa de fluxo de perfusão de 2 ml / min e uma temperatura de 37 ° C na câmara de gravação. </li><li> Use uma NA objetivo de imersão em água 20X 0,95. Se disponíveis, utilizar uma câmara de CCD, em combinação com uma câmara de registo abaixo LED infra-vermelho para localizar a fatia da retina (Figura 2). Caso contrário localizar fatia usando a imagem latente de dois fótons (ver 3.1.5). </li><li> Mudar para a imagem de dois fótons para ver expressão biossensor. Ligaros dois canais de detecção de imagens de fluorescência de ECFP e citrino. </li><li> Use o software de aquisição de imagem que controla o microscópio de dois fótons para digitalizar e selecionar uma linha de terminais de cone para a gravação (Figura 3A). Conjunto de aquisição de imagem a 128 x 16 imagens de pixel (31,25 Hz) ou uma configuração similar. Restringir a área digitalizada para terminais de cone para evitar o branqueamento de photopigments em segmentos externos. Nota: Para o sensor TN-XL cálcio (τ = ~ 0,6 seg para Ca 2+ vinculativo, τ = ~ 0,2 seg para Ca 2+ unbinding, ver 16) a taxa de quadros mínima de 8 ~ Hz é recomendado. </li></ol></li><li> Estimulação luminosa e gravação <ol><li> Use um sub-stage-campo cheio de luz estimulador como descrito em outros lugares 10,21,26 para executar as seguintes etapas. Nota: Uma solução simples para um estimulador luz de campo total é usar dois LEDs band-pass-filtradas (por exemplo, &quot;azul&quot;: 360 BP 12, &quot;verde&quot;: 578 BP 10)que corresponde as sensibilidades de comprimento de onda de cones de ratinho, mas ao mesmo tempo não se sobrepõem com os filtros utilizados para a detecção de fluorescência (cf 3.2.4.). A luz proveniente dos LED é focada pelo condensador através da parte inferior da câmara de registo (Figura 2). Para mais detalhes sobre este projeto estimulador, a sua calibração, as intensidades de luz utilizada e as taxas de cone de foto-isomerização evocadas, ver 10,21,26. </li><li> Ligue o laser e permitem cones para adaptar-se ao varrimento a laser e a luz de estímulo fundo (20 - 30 segundos, ver também Armadilhas Potenciais) antes de apresentar estímulos luminosos (ver 3.2.3) ou a aplicação de agentes farmacológicos. </li><li> Iniciar a apresentação de estímulos arbitrários (por exemplo, ondas de luz, como mostrado na Figura 3B, C). No caso de o estimulador descrito no passo 3.2.1, gerar os estímulos através da modulação da intensidade dos dois LEDs ao longo do tempo usando uma placa de microprocessador controlado por software personalizado (pordetalhes, ver 10,21,26). </li><li> Comece a gravar os dois canais de fluorescência (por exemplo, em 483 nm para &quot;blue&quot; FRET-doador ECFP e a 535 nm para &quot;amarelo&quot; FRET-receptor;. Para especificações ver Tabela 1), simultaneamente utilizando o respectivo software de aquisição de imagem (ver também 3.1 0,6). Por exemplo, no caso de flashes de luz (Figura 3B, C), ficha de pelo menos 8 - 10 apresentações de estímulo (ensaios). </li></ol></li><li> Ca 2+ calibração &quot;In-slice&quot; <ol><li> Ficha de Ca2 + sinais nos terminais de cone (como descrito em 3.1.6 e 3.2.4) e extrair a linha de base do nível de Ca2 + em um conjunto de cones (como descrito em 3.4). </li><li> Mudar para &quot;Ca 2+ livre&quot; meio extracelular com 5 ionomicina? M (dissolvido em DMSO) e EGTA 10 mM (ou, alternativamente, BAPTA) acrescentou. Terminais da ficha cone de novo a cada 5 minutos para determinar a proporção de fluorescência mínima (R min), &lt;em&gt; isto é, o ratio no (próximo) ausência de Ca2 + intracelular. Isso pode demorar entre 15-30 min. Nota: Um sistema de perfusão é necessário que permite a comutação entre diferentes reservatórios. </li><li> Mudar para meio extracelular com 5 ionomicina? M (dissolvido em DMSO) e Ca 2+ 2,5 mM. Após um tempo de incubação de 5 min, cones de ficha de novo a cada 5 minutos para medir a proporção de fluorescência máxima (R máx), ou seja, a proporção, na presença de concentrações saturantes de Ca2 + intracelular. Após a aplicação ionomicina, pode demorar entre 3 - 15 min para a relação Ca 2+ para se tornar estável. Nota: Expor as fatias de alta Ca 2+ e ionomicina durante um período mais longo, eventualmente danificar as células. Inclua apenas as células na análise que mantêm a sua morfologia normal. Concentrações (ou seja, EGTA, ionomicina) pode precisar de ser adaptado. Para mais detalhes sobre a calibragem Ca 2+protocolo, consulte 13,17. </li></ol></li><li> Análise de dados Nota: Use um pacote de software de processamento de imagem e análise de dados compatível com o respectivo software microscópio e capaz de executar scripts de análise personalizadas. <ol><li> Carregar um ficheiro de dados de imagem e desenhar regiões de interesse (ROI) em torno de cada terminal de cone (Figura 3A). Para cada trama, a intensidade média de fluorescência dentro da ROI e subtrair a fluorescência de fundo, antes de calcular a relação (r) entre aceitador FRET (citrino) e do dador (ECFP) fluorescência (R = F A / D M; Figura 3B, C). Este rácio é normalmente usado como um proxy para o parente concentração intracelular de Ca2 +, mas após a calibração (ver 3.3), também concentrações absolutas pode ser estimado (ver 3.4.3). Nota: Os pedículos pode ser reconhecido pela sua localização na camada plexiforme externa e a sua morfologia (um tanto achatada &quot;bolhas&quot; menor do que o conesomata, localizado na extremidade do cone axonal). </li><li> Média de ensaios de estímulo (Figura 4A). Extrair parâmetros de resposta a partir de vestígios médios (Figura 4B), tais como Ca 2+ nível da linha de base (base de P) antes da estimulação com luz, a amplitude de pico (Ampr), e área sob a curva (R A) tal como medidas de tamanho de resposta. Além disso, extrai-se a cinética de resposta a partir de vestígios em média, tais como aumento de resposta (t origem) e tempo de decaimento (t decaimento) (= respectivos intervalos de tempo entre 20% e 80% de R amp; ver ilustração na Figura 4B). Para mais detalhes sobre como determinar esses parâmetros, consulte 10. </li><li> Calcular uma estimativa do cone absoluta concentração de Ca2 + com base nas medições de passos 3.3.1-3.3.3. Use as proporções para mínima e máxima concentração de Ca2 +, R min e Rmax, respectivamente, a fluorescência do dador no Ca 2+ </saté&gt; -bound (F D, Ca-ligado) e -unbound (F D, Ca-livre) estado, bem como in vivo a constante de dissociação (K d = 0,77, ver 16) para TN-XL com a seguinte equação (analógico a 27): </li></ol></li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" />

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+interactions+in+the+outer+retina.">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina.">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa:+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms.">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e488 (2013).</li><li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function.">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Protocolos pré-existentes usando gravações unicelulares eletrofisiológicos ou Ca 2+ imagem com indicadores sintéticos fluorescentes lutam para gravar as Ca2 + dinâmica no rato cones fotorreceptores para um número de razões técnicas (ver Introdução). O protocolo aqui descrito permite a medição de sinais de Ca2 + e até absolutos níveis de Ca 2+ em terminais, identificadas rato cone individuais de uma forma eficiente e relativamente simples. Este protocolo já foi utilizado com sucesso em três estudos abordando diferentes aspectos da função cone na retina saudável mouse. No primeiro estudo 10, o HR2.1: rato TN-XL foi caracterizado usando imuno-histoquímica, registos de ERG, dois fotões Ca 2+ de imagem, e farmacologia, que mostra que a expressão específica de cone do Ca 2+ biossensor não entrave cone anatomia e função. No segundo estudo, 21, cromáticoe propriedades de resposta acromáticas de cones de rato foram mapeados em toda a retina, demonstrando diferenças marcantes em função de cone entre a dorsal &quot;verde&quot; dominado pelos opsina eo &quot;azul&quot; ventral retina do rato-dominado opsina. Estas diferenças regionais nas propriedades cone combinando a distribuição do contraste diferencial no ambiente natural (isto é, contra o céu do solo), o que sugere que os diferentes tipos de cones espectrais do rato para proporcionar (próximo) de amostragem óptima de contrastes acromáticos e, assim, podem oferecer um vantagem evolutiva. No terceiro estudo 22 o feedback recíproco que os terminais de axónios cone receber a partir de células horizontais foi investigada. Como todos os mecanismos de feedback célula horizontal propostas agir em voltagem dependentes canais de Ca2 + nos terminais cone axônio 28, terminal de cone de Ca 2+ pode servir como um proxy em interações horizontais célula-cone. O estudo de Kemmler e colaboradores 22 apoiosa visão de que células horizontais utilizar um sistema de feedback complexo constituído por vários mecanismos para controlar a liberação de glutamato fotorreceptor. Esses estudos ilustram a versatilidade do protocolo descrito e mostram que pode ser adaptada a uma vasta gama de questões relacionadas função dos cones e dos seus circuitos sinápticos. Além disso, o protocolo permite estudar locais de sinalização de Ca2 + nos diferentes compartimentos de cone, para uma melhor compreensão da fisiologia cone. Tal conhecimento é importante para compreender os processos fisiopatológicos em cones degeneração, para, eventualmente, permitir o desenvolvimento racional de potenciais abordagens terapêuticas, em especial para doenças degenerativas que afetam cones. No HR2.1: linha rato TN-XL, o Ca 2+ biossensor é expressa ao longo do cone, com a excepção de o segmento exterior. Isso fornece uma oportunidade para avaliação direta e ratiometric de Ca 2+ dinâmicas em diferentes compartimentos do cone. Dado que alterações no Ca2 + correntes no segmento exterior são reflectidas em terminais via o potencial de membrana e a resultante activação de canais de Ca2 + dependentes da voltagem, os processos no segmento exterior pode ser observada indirectamente. Armadilhas potenciais: A dissecção da retina é uma etapa crítica: No rato, a retina se separa da ocular geralmente entre segmentos externos de fotorreceptores e epitélio pigmentado. Portanto, os fotorreceptores sensível à luz segmentos exteriores da retina isolada estão expostos e extremamente sensível a danos mecânicos. Grande cuidado deve ser tomado para não danificar tocando lado do fotorreceptor com ferramentas ou movendo o tecido de lado sobre uma superfície adesiva (por exemplo, uma membrana de filtro). Fatias da retina de alta qualidade pode ser reconhecido sob o microscópio por sua superfície de corte limpo epor uma camada de fotorreceptores bem organizado, com segmentos externos claramente definidos. A avaliação funcional de qualidade fatia pode ser feita rapidamente através do escoamento estímulos luminosos brilhantes e determinando a percentagem de cones responsivos (por exemplo, em um campo de visão com 10 - 20 cones). Aqui, a qualidade da resposta deve ser avaliado por meio do cálculo da razão sinal-para-ruído (S / N) (amplitude do ruído de linha de base antes do estímulo de luz versus amplitude da resposta de luz); A S / N de 2-3 deve ser considerado como o limite mínimo. Normalmente, descartamos fatias com menos de 50% cones responsivos. Também corta com cones que exibem comportamento spiking espontânea excessiva (ver Figura 4 em 10) deve ser descartada. Fatias na câmara de gravação que atendem aos critérios anatômicos e funcionais acima mencionados apresentam respostas consistentes para 1-2 hr (para obter detalhes sobre a consistência de resposta, consulte 10). Porque fatias sobreviver por hnosso na câmara de retenção, uma experiência bem sucedida pode durar até 6 horas. Vale ressaltar que existem algumas restrições no que diz respeito ao estudo de longo-variando interações espaciais entre cones e células horizontais, como cortar inevitavelmente rompe conexões laterais em redes de retina. No entanto, o aumento da espessura das fatias da retina a 300 um melhora esta questão 22. O uso de fatias verticais da retina evita a sintonização dos segmentos exteriores do cone sensível à luz por o laser de excitação e, assim, em grande parte, evita branqueamento opsina (para discussão extensa, ver 10,21). No entanto, os sinais gravados de Ca2 + não só dependem dos estímulos de luz, mas também ficar afectado por um componente de iluminação de fundo gerado pelo laser de excitação digitalização. Na verdade, a iluminação de fundo eficaz em tais experiências de imagiologia de dois fótons é uma combinação de luz laser dispersa, de luz fluorescente emitida pelo ce gravadolls, e qualquer componente de fundo LED estímulo. Portanto, cones devem ser autorizados a se adaptar por pelo menos 20 - 30 s para varrimento a laser (com o componente de fundo do estímulo de luz ligada) antes da gravação. Vantagens e aplicações: Enquanto algumas aplicações para este cone Ca 2+ protocolo -Imaging foram descritos acima 10,21,22, outras aplicações podem ser imaginado: estudos farmacológicos em combinação com cone de Ca 2+ de imagem pode validar Ca 2+ vias de sinalização em cones e poderia ser usado para testar a eficácia ea potência dos fármacos dirigidos a diferentes jogadores em Ca 2+ -signaling 10. No entanto, um aplicativo pode ser chave para estudar doenças que afetam a função cone. Muitos modelos da retina degeneração do rato que imitam doenças humanas estão disponíveis. Por exemplo, a perda de fotorreceptores cone 1 (CPFL 1) mouse é um cone principal modelo de degeneração sofrimentoa partir de uma mutação Pde6c 29. Por outro lado, a haste de rato degeneração 1 (rd 1) sofre uma mutação Pde6b. Enquanto isso faz com que haste principal degeneração de fotorreceptores 30, uma vez rd uma perda haste é concluída, conjuntos de cone degeneração secundária em 1. O cruzamento desses animais com o HR2.1: Linha TN-XL permitirá estudar e comparar Ca2 + dinâmica, tanto primária e secundária cone degeneração e é susceptível de proporcionar insights valiosos sobre o papel dos Ca2 + durante a morte celular cone. Além disso, farmacologicamente induzido degeneração cone - por exemplo, o uso de inibidores seletivos EFD6 - pode servir para identificar os mecanismos a jusante do cone degeneração 10,29,31. Em resumo, o protocolo descrito aqui permite medir Ca 2+ em compartimentos subcelulares de fotorreceptores rato cone e apresenta grandes oportunidades para descobrir cone fisiologia sob uma ampla gamadas condições fisiológicas e fisiopatológicas. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o rastreio de agentes farmacológicos desenvolvidos para interferir com cone Ca 2+ -signaling e, assim, ajudar a estabelecer novas terapias para doenças cone.

Visão começa com a activação induzida por luz da cascata de fototransdução em fotorreceptores retinais. Bastonetes permitir a visão em níveis baixos de luz, enquanto cones fotorreceptores mediar cor e alta resolução de visão luz do dia. Muitos genes específicos de fotorreceptoras são susceptíveis a mutações que conduzem à degeneração destas células. Um número de marcadores moleculares associados a perda de fotorreceptores foram identificadas 1, mas até agora os mecanismos moleculares detalhadas e a sequência de eventos permanecem obscuros. Altered homeostase de Ca2 + foi especulado para ser um gatilho de morte celular de fotorreceptores, uma hipótese suportada pela sobre-regulação da actividade de proteases dependentes de Ca2 + do tipo calpaina durante o processo de degeneração 2,3. No entanto, até à data, esta hipótese não é apoiada por medidas fisiológicas de Ca 2+. Inconsistências em diversos estudos sobre o efeito de bloqueadores dos canais de Ca 2+ em redoenças Tinal desafiou ainda mais o envolvimento dos Ca2 + na morte celular 4-6, pedindo métodos para avaliar directamente Ca2 + em cones fotorreceptores mamíferos. Anteriormente, a maioria gravação elétrica e estudos de imagem Ca 2+ foram realizados em modelos de anfíbios e répteis por causa do acesso mais fácil aos cones 7-9. No entanto, a fisiologia dos mamíferos de fotorreceptores pode ser diferente do que a do não-mamíferos e, especialmente, 10, no contexto de degeneração retinal hereditária humana, uma melhor compreensão da fisiologia de mamíferos fotorreceptores é uma chave para o desenvolvimento de tratamentos inovadores. Muitos modelos de ratos que imitam doenças da retina humanos estão disponíveis, mas pouco se sabe sobre a dinâmica de Ca2 + em cones de rato 11. Técnicas eléctricas não são adequados para gravações de alto rendimento a partir de cones, em particular, não em ratinhos, em que as hastes (~ 97%) significativamente mais numerosos cones (~ 3%) 12 </sup&gt;. Além disso, técnicas electrofisiológicas sensíveis, tais como gravações de células inteiras de patch-clamp perturbar o meio intracelular e fornecer dados sobre as correntes de Ca2 + mas não em concentrações intracelulares de Ca2 + absolutos. Assim, apesar da resolução temporal inferior, imagem latente é o método de escolha no tratamento de questões sobre cone Ca 2+ dinâmica. A questão-chave com imagens é como rotular selectivamente os cones com um corante indicador fluorescente Ca 2+. Compartimentalização adequada e especificidade celular é difícil de alcançar por &quot;a granel-loading&quot; sintética Ca 2+ corantes indicadores no tecido. Como conseqüência, cones rotulados, hastes 13,14, e células gliais de Müller não pode ser confiavelmente distinguidos. Além disso, os corantes sintéticos tendem a vazar para fora das células, impedindo gravações prolongados em condições consistentes. Além disso, o carregamento sintéticos indicadores de Ca2 + na sua forma de éster AM é problemática, uma vez que requer detergents (por exemplo, DMSO) e gera formaldeído 15. Para absolutos Ca 2+ medidas, os indicadores raciométrica são obrigatórios. No entanto, o melhor indicador raciométrica sintéticos actualmente disponíveis Fura-2 requer a luz de excitação na gama de 700-760 nm (para a excitação de dois fotões), que, em função da sua intensidade, pode, por si só estimular os cones, e, assim, impedir de estudos cone de Ca 2+ funcionamento sob condições de iluminação fisiológicas. Ao contrário dos corantes sintéticos, geneticamente codificados indicadores de Ca2 + pode ser expressa de uma maneira selectiva de células-tipo. Eles não escapam para fora das células, e, por conseguinte, se o branqueamento é evitada, medições raciométrica prolongados e fiáveis ​​são possíveis. Tipo seletivo celular expressão de Ca2 + biossensores, quando combinado com a microscopia de dois fótons, representa uma poderosa ferramenta para avaliar e estudar subcelular Ca 2+ em condições fisiológicas, em grande parte 13,16,17 </sup&gt;. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a luz evocada pelo estímulo cone Ca 2+ dinâmica em um transgênico Ca 2+ linha biossensor rato (HR2.1: TN-XL), que expressa a baseada em FRET Ca2 + biossensor TN-XL 18 seletivamente em cones, sob a opsina humano vermelho promotor HR2.1 19. Para acessar os terminais de cone, uma preparação fatia ex-vivo 20 foi empregado. O protocolo já foi utilizado com sucesso em três estudos sobre a função cone em ratos saudáveis ​​10,21,22. Além disso, o protocolo permite estudar cone de sinalização de Ca2 + em condições genéticas específicas, por exemplo, cruzando modelos de ratos para a degeneração da retina hereditária com HR2.1: ratos TN-XL.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for tissue chopper</td>
			<td>MARTOR KG</td>
			<td>ARGENTAX No. 1044</td>
			<td>0.25 mm; http://www.martor.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose filter membrane gridded</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AABG01300</td>
			<td>Filter type: 0.8 &#181;m; http://www.emdmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP</td>
			<td>CP pharma</td>
			<td>AP/DRUGS/220/96</td>
			<td><a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/green LED-based full-field stimulator</td>
			<td>Custom-build</td>
			<td></td>
			<td>for details, see10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open source microprocessor board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software CfNT</td>
			<td>Custom-written</td>
			<td></td>
			<td>developed by Michael M&#252;ller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC3-4 System focal perfusion system</td>
			<td>ALA Scientific Instrument</td>
			<td></td>
			<td>with 100 &#956;m-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)</td>
			<td>Newport Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Movable objective microscope (MOM), 
			Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPlanFL 20x/0.95w objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer 100 series</td>
			<td>Surgivet</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.surgivet.com/">http://www.surgivet.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Calcium salt</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I24222</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101191250</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ95</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina

Cones fotorreceptores da retina (cones) servir visão luz do dia e são a base da discriminação de cor. Estão sujeitos a degeneração, conduzindo muitas vezes a cegueira em muitas doenças da retina. O cálcio (Ca 2+), de um segundo mensageiro chave na sinalização de fotorreceptores e metabolismo, tem sido proposto para ser indirectamente ligada com a degeneração de fotorreceptores em vários modelos animais. Estudar sistematicamente estes aspectos de fisiologia e patofisiologia cone tem sido dificultada pelas dificuldades de gravação electricamente a partir destas pequenas células, em particular no rato onde a retina é dominada por bastonetes. Para contornar este problema, foi estabelecido um protocolo de imagem de dois fótons Ca 2+ usando uma linha de rato transgénico que expressa o codificado geneticamente Ca 2+ biossensor TN-XL exclusivamente em cones e podem ser cruzados com modelos de ratos para degeneração de fotorreceptores. O protocolo aqui descrito envolve a preparação de secções verticais (R20; fatias &quot;) de retinas de ratos e imageamento óptico de luz muda evocadas por estímulo em cone Ca 2+ nível. O protocolo também permite que &quot;medição in-slice&quot; de concentrações absolutas de Ca2 +; como as gravações pode ser seguido por calibração. Este protocolo permite estudos em propriedades funcionais de cone e espera-se contribuir para a compreensão do cone de sinalização de Ca2 +, bem como o envolvimento potencial de Ca 2+ no fotorreceptor morte e degeneração da retina.

Ao combinar fatias verticais (Figura 1) preparada a partir de HR2.1: TN-XL do mouse retina com a imagem de dois fótons (Figura 2), fomos capazes de realizar medições raciométrica de luz Ca2 + sinais evocadas por estímulo em terminais do axônio cone fotorreceptoras . Esta abordagem representa uma melhoria significativa no acesso e visualização de cones do mouse sobre os métodos de imagem óptica pré-existentes com sintéticos de Ca2 + indicadores. Por exemplo, a expressão específica de cone do Ca raciométrica geneticamente codificado 2+ biossensor TN-XL facilitou grandemente a identificação de terminais de axónios cone (ROIs ver na Figura 3A). Portanto, o nosso protocolo elimina o risco de sinais de gravação de origem obscura, como por exemplo sinais &quot;mistos&quot;, com contribuições de ambos os cone e rod axônio terminais. Nossa abordagem permite resolver as respostas de um único julgamento no nível do indiviterminal de duplo cone axônio. Extrusão claro evocada de Ca2 + a partir do terminal do cone é marcado por um aumento e uma diminuição da fluorescência de dador e aceitador, respectivamente (Figura 3B). Diminuição da taxa de fluorescência (I) corresponde a extrusão de Ca2 + a partir do terminal do cone (Figura 3C), causada pela hiperpolarização induzida pela luz do cone e subsequente fecho de canais de Ca2 + dependentes da voltagem. Porque vários terminais cone axônio pode ser monitorada simultaneamente (Figura 3A), aquisição de dados é muito eficiente e centenas de respostas cone de Ca 2+ pode ser recolhida em um único experimento. Ao avaliar quantitativamente estas respostas (Figura 4), ​​do cone de Ca2 + sinais podem ser comparados e avaliados numa gama de condições (ver discussão). É muitas vezes suficiente usar a razão entre aceitador FRET (citrino) e -donor (ECFP) fluorescência(F A / F D; para detalhes, ver 3.4) como uma medida relativa do nível intracelular de Ca2 +. No entanto, sempre que necessário, a proporção pode ser calibrado para obter concentrações intracelulares de Ca2 + absolutas ([Ca 2+]) (Figura 5). Na iluminação de fundo usado neste protocolo (para detalhes, ver 10 e Figura 3 lenda), calibração produziu uma estimativa para o descanso absoluto [Ca 2+] em &quot;wild-type&quot; HR2.1: TN-XL terminais rato cone de 243 ± 159 nM (média ± DP), que está dentro do intervalo referido para os ratos na literatura 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação de fatias verticais da retina. (A) isolado e achatados retina preparado para cortar. (B) pedaço retangular de retina (see caixa vermelha em A) montado na membrana de papel de filtro (cinza escuro) após o corte. (C) Vista de cima da fatia da retina montado na membrana fixos em uma lamela de vidro com massa. (D) Desenho esquemático de uma parte de uma fatia da retina (ver caixa vermelha C). Cones fotorreceptores são indicados em verde. V ventral; D, dorsal; N, nasal; T, temporais; OS, segmento exterior; ONL, camada nuclear exterior; OPL, camada plexiforme externa; INL, camada nuclear interna; IPL, camada plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> Figura 2. Dois fótons de imagem de fatias da retina: Ilustração da configuração de gravação Top:. Água-imersão lente objetiva focar a seram do laser de varredura (seta para baixo vermelho) na retina, e recolher a fluorescência emitida (setas para cima). A lente também recolhe a luz infravermelha transmitida a partir de um diodo emissor de luz montado por baixo do condensador na obtenção de imagens da fatia utilizando uma câmara CCD Centro:.. Fatia da retina montada na câmara de gravação e perfundidos com solução extracelular inferior: Condensador lente de focagem a luz proveniente dos LED de estimulação (eo LED infravermelho para geração de imagens da câmera CCD) através do fundo transparente da câmara de gravação para o tecido da retina. LED IR, infravermelho diodo emissor de luz; CCD, um dispositivo de acoplamento de carga; BP, passa-banda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> Figura 3. Light-de evocarrespostas d Ca 2+ em terminais do axônio de fotorreceptores rato cone. (A) Esquerda: Recordings focados em terminais sinápticos (caixa vermelha) de cones fotorreceptores (verde) em fatias da retina direita:. Exemplo para uma região gravada com sete terminais individuais. A fluorescência foi registada usando dois canais:. Um para o citrino FRET-receptor (parte superior; 535 BP 50) e um para o doador FRET-ECFP (inferior; 480 BP 32) (B) mudanças de luz evocada em citrino (F A) ECFP e (F D) fluorescência registados num único ROI. respostas (C) de Ca 2+ (como razão F A / D F) de um terminal de cone para uma série de 1 seg flashes de luz brilhante na intervalos de 5 seg. ROI, região de interesse; BP, filtro passa-banda; F, a intensidade de fluorescência; au, unidades arbitrárias; FRET, Förster transferência de energia de ressonância; ECFP, reforçada proteína fluorescente ciano. Intensidade do estímulo (como ptaxa hoto-isomerização em 10 3 · P · s -1 por cone):. 13,0 e 12,8 por M e S-opsinas, respectivamente, adicionando em um nível de fundo (= LEDs fora, varredura a laser de excitação) de ~ 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> Figura 4. análise quantitativa Exemplar de cone de luz evocada Ca 2+ respostas (A) Luz evocadas Ca 2+ respostas (como ΔR) de um único terminal de cone (ensaios individuais: traços de cinza, n = 16; média:. Traço preto ) (b) Parâmetros determinado para a média de Ca 2+ resposta:. de descanso nível de Ca2 + (base R) que representa a linha de base antes da estimulação luz, tamanho de resposta como AREA-sob-a-curva (RA) e amplitude de pico (Ampr), cinética de aparecimento de resposta (t origem, intervalo de tempo de 20% a 80% de R AMP) e deslocamento (t decaimento, intervalo de tempo de 80% a 20% dos R amp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> Figura 5. Estimativa de absoluta concentração de Ca2 +. Descansar concentração de Ca2 + ([Ca2 +], como a relação F A / D F) registrado em terminais do axônio 8 cone em um mouse TN-XL (círculos, com média ± SD) para soluções extracelulares diferentes: duas vezes em meio extracelular padrão Ctrl (1 e 2), em seguida, com o mínimo (&quot;zero&quot;) [Ca2 +] (10 mM de EGTA) umd com alta [Ca 2+] (2,5 mM), as duas últimas condições, na presença de 5 mM ionomicina para equilibrar Ca 2+ extracelular e intracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

10.5K visualizações.  University of Tübingen.  Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato. 

Vídeo: Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Neurociência

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...