This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

NOTA: A manipulação de animais e experimentos foram realizados conforme aprovado pelo Comitê Universidade de Göttingen de Ética em Experimentação Animal. 1. Preparação de Instrumentos e Pipeta Fabrication <ol><li> Certifique-se de que a configuração eletroporação consiste de um microscópio estereoscópico com grande distância de trabalho e está equipado com iluminação e filtro conjuntos fluorescentes para o corante usado. </li><li> Para eletroporação usar um electroporador única célula dedicada ou um gerador de pulso quadrado genérico ligado a um osciloscópio. Ligue as saídas electroporador a um titular pipeta e um eletrodo de banho. Ligar o terminal positivo do gerador de impulsos ao titular da micropipeta e o terminal negativo para o banho de eléctrodo. Assegure-se tanto o titular da pipeta e o eléctrodo do banho conter fios de prata revestidos com uma fina camada de cloreto de prata. </li><li> Montar o suporte da pipeta em um micromanipulator para permitir o posicionamento exato. </li&gt; <li> Fabricar micropipetas eletroporação de capilares de vidro de borosilicato com filamento interno. </li><li> Usar um puxador de micropipeta horizontal e aplicar um protocolo modificado para a fabricação de pipetas para experiências de fixação de membranas como descrito por Bestman et al. 13. </li><li> Adaptar os parâmetros para produzir uma haste mais longa e uma abertura menor ponta resultando em uma resistência pipeta maior de cerca de 15-20 MOhm para eletroporação única célula. A resistência pipeta deve ser inferior, por exemplo, 3-4 MOhm, para rotulagem de grupos de células. </li><li> Medir a resistência pipeta, quer directamente com um electroporador de uma única célula dedicado ou calcular-o com a lei de Ohm depois de medir o fluxo de corrente com um osciloscópio após a aplicação de um impulso de tensão definida. </li></ol> 2. Preparação de Solução A electroporação <ol><li> Dissolver dextrano-coupled fluoróforo em sapo campainha (NaCl 98, KCl 2 mM, 1 mM de CaCl2, MGC 2 mMl 2, 5 mM de glucose, 5 mM de Na-piruvato, HEPES 10 mM, ajustado para pH 7,8, a osmolaridade foi de 230 mOsmol / l) a uma concentração de 3 mM. As células não podem ser tão intensamente marcado se concentrações mais baixas de corantes são usados. Prepare uma solução estoque grande volume e dividi-lo em pequenas alíquotas. Congelá-los para armazenamento (estável por meses). NOTA: Os dextranos estão disponíveis em diferentes tamanhos e uma variedade de espectros de emissão / excitação (por exemplo, Alexa 488-dextrano 10 kD, Alexa 546-dextrano 10 kD, Alexa 568-dextrano 10 kD, Alexa 594-dextrano 10 kD, TMR-dextrano 3kD.). </li><li> Backfill a micropipeta com uma ponta de pipeta alongada com um pequeno volume de solução de dextrano (1-5 ul). Agite cuidadosamente a micropipeta com o dedo para remover as bolhas de ar residuais a partir da ponta da pipeta. </li><li> Montar o micropipeta no suporte da pipeta. Certifique-se de que o fio de prata dentro da pipeta está em contacto com a solução de corante. </li></ol> 3. Seleção de larval X. laevis &lt;/ Em&gt; <ol><li> Use larvas albino de X. laevis para os experimentos. Animais tipo selvagem possuem melanóforos cheios de pigmento que mostram emissão autofluorescência durante confocal / multiphoton imagem e não são, portanto, adequados para os experimentos descritos. </li><li> Estágio girinos premetamorphotic após Nieuwkoop e Faber 14. Selecione girinos de etapas 45-53 para os experimentos. </li></ol> 4. A electroporação de Dextranos Fluoróforo-acoplados <ol><li> Coloque um pequeno pedaço de tecido em uma placa de Petri e cobri-lo com um pequeno volume de água contendo 0,02% tricaina (Acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato, ajustado para pH 7). </li><li> Anestesiar os girinos em água contendo 0,02% tricaina. Depois de alguns minutos, os animais deixam de se mover. Confirme anestesia adequada tocando girinos. Eles devem ser não-responsivos. </li><li> Transferir cuidadosamente o girino do anestésico para o tecido coberto placa de petri. </li><li> Certifique-se que o banho electrode fecha o circuito de eletroporação. Certifique-se de que o eléctrodo está em contacto com o tecido molhado; um contacto directo com o girino não é necessário. </li><li> Posicione a ponta da micropipeta perto do olfacto usando o micromanipulator. </li><li> Penetrar a pele que cobre o órgão olfativo com a ponta da pipeta e cautelosamente avançar a ponta na camada de neurônio sensorial localizado no centro da principal epitélio olfatório ou epitélio vomeronasal. </li><li> Desencadear impulsos positivos de tensão quadrada para transferir corante em neurônios sensoriais. Aplicar um único pulso de tensão (por exemplo., 25 V, comprimento de pulso de 25 ms) ou trens de pulsos múltiplos (eg., 50 V, comprimento de pulso de 300 ms, 400 ms de duração de trem a 200 Hz). NOTA: Determinar parâmetros de pulso de tensão ideais para a desejada extensão da rotulagem. Reduzir a amplitude do impulso de tensão, a duração e número de repetições para diminuir o número de células marcadas. Aplicar maior amplitude de pulso de tensão, duração e número de pulses para uma rotulagem mais difundido. </li><li> Visualize extrusão corante sucesso e eletroporação por pulsos disparados com uma iluminação fluorescente do microscópio estereoscópico. O corante difunde rapidamente para dentro do corpo celular e dendritos após a electroporação bem sucedida. </li><li> Repita os passos de 4,5-4,9 para o segundo órgão olfativo do girino. </li><li> Transferir o girino para um copo cheio de água fresca para a recuperação. Depois de ca. 5 min os girinos acordar da anestesia e iniciar movimentos normais de natação. </li><li> Após 24 horas o corante electroporados espalha nos neurônios sensoriais e, eventualmente, atinge o bulbo olfatório via transporte axonal. </li></ol> 5. Os animais de montagem para In Vivo visualização de células e processos axonais <ol><li> Anestesiar os girinos em água contendo 0,02% tricaina. </li><li> Transferir cuidadosamente girinos em uma câmara de imagem, por exemplo, uma pequena borracha de silicone coberto com uma placa de petri de tamanho recesso-girino. &lt;/ Li&gt; <li> Corte um pequeno retângulo em uma faixa de Parafilm. Cubra o girino com o Parafilm, deixando o telencéfalo anterior exposto através da janela de recorte. Corrigir o Parafilm com agulhas no prato sem ferir o girino. </li><li> Certifique-se o girino é submerso em água suficiente contendo 0,02% tricaina. </li><li> Monte a câmara de imagem no palco de um microscópio multiphoton vertical ou microscópio confocal. </li><li> Adquirir uma pilha de imagens do bulbo olfatório tridimensional. Certifique-se que o procedimento de imagem é o mais curto possível e não exceda 10-15 min. </li><li> Retorne o girino em água normal em um tanque separado e evitar a exposição à luz. Após 5 min, o girino acorda da anestesia. </li><li> Repita os passos 5,1-5,7 após intervalos de tempo especificados, por exemplo., Todos os dias. </li></ol> 6. Os animais de montagem para Ex Vivo visualização de células e processos axonais <ol><li> Como alternativa para a seção 5do protocolo, use uma preparação cérebro extirpado para visualizar os neurônios sensoriais rotulados. </li><li> Anestesiar e matar o girino por transecção do cérebro, na transição para a medula espinhal. Especiais sobre o consumo de um bloco de tecido contendo os órgãos olfativos, os nervos olfatórios e telencéfalo anterior. </li><li> Transfira o bloco de tecido para solução de Ringer rã e remover o tecido conjuntivo com uma tesoura fina para expor o lado ventral do cérebro. </li><li> Transfira o bloco de tecido para uma câmara de imagem e corrigi-lo com uma moldura de platina cordas com fios de nylon. </li><li> Monte a câmara de imagem no palco de um microscópio confocal / multiphoton. </li><li> Adquirir uma pilha de imagens do bulbo olfatório tridimensional. </li></ol> 7. Processamento de Imagem e Avaliação de Dados <ol><li> 15 optimizar e aplicar meios não-locais de filtragem para melhorar a qualidade de imagem e visualização das estruturas neuronais, como descrito por coupé, P. et al.. NOTA: Os dados de experimentos com imagens em camadas mais profundas do tecido de espécimes vivos são muitas vezes barulhento. </li><li> Criar projeções de intensidade máxima das pilhas de imagens para uma visão geral. </li><li> Por lapso de tempo experimentos com imagens de tela conjuntos de dados para os axônios inequivocamente identificáveis ​​únicas de neurônios sensoriais. </li><li> Reconstruir morfologia celular via rastreamento de processos neuronais assistida por software como descrito por Peng et al. 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells.">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li><li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system.">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li><li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. 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S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), (2008).</li><li>Gliem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+processing+of+olfactory+information+in+an+amphibian+nose:+odor+responses+segregate+into+a+medial+and+a+lateral+stream.">Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream.</a> Cell. Mol. 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Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Nezlin, L. P., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+olfactory+sensory+neurons+project+into+more+than+one+glomerulus+in+Xenopus+laevis+tadpole+olfactory+bulb.">Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).</li><li>Nagayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+tracing+and+Ca2++imaging+of+local+neuronal+circuits.">In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits.</a> Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O procedimento experimental descrito aqui permite rotulagem neurónios sensoriais do órgão olfactivo larvar de X. laevis por electroporação de dextranos acoplado-fluoróforo e visualização subsequente do crescimento axonal sensorial no animal vivo. Ao variar os parâmetros do electroporação in vivo, é possível controlar o número de neurónios sensoriais marcados. É, assim, possível rotular grandes grupos de neurônios de um epitélio sensorial, muito poucos ou mesmo células individuais. Para garantir a desejada extensão da rotulagem neuronal é importante ser particularmente cautelosos sobre as características micropipeta e os pulsos eletroporação. As resistências das pipetas mais elevadas e redução do impulso de tensão de amplitude, a duração e número de repetições pode reduzir a quantidade de células marcadas, enquanto diminuir as resistências das pipetas e maior amplitude do impulso de tensão, a duração, o número de impulsos pode levar a rotulagem mais generalizada. The uso de dextrans fluorescentes para eletroporação fornece feedback visual imediato, se as configurações aplicadas são adequadas. Tenha cuidado para que o uso de parâmetros de amplitude, duração e número de pulsos que excedem os valores previstos no protocolo pode potencialmente levar a danos celulares ou até mesmo a morte celular 17. Dicas entupidos ou quebrados de micropipetas também pode dificultar a eletroporação de sucesso. Em electroporação in vivo no órgão olfactivo de X. laevis está limitada a fases larvares uma vez que a pele de rãs postmetamorphotic é mais resistente e não pode ser facilmente penetrada com uma micropipeta. A visualização in vivo de processos neuronais pode ser prejudicado por espalhamento de luz de excitação / emissão de áreas cerebrais mais profundas ou por vasos sanguíneos. Este problema torna-se especialmente evidente nos estágios larvais mais elevados devido a um cérebro maior e pode levar a sinais ruidosos que fazem a identificação clara dos processos axonais finos mais difícil. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; permite que o protocolo apresentado para visualizar os neurônios sensoriais no sistema olfativo intacta, sem dissecar o animal, danificando as células durante a etiquetagem, preparação de fatias de tecido ou a fixação do tecido como necessário para métodos alternativos, como rotulagem no patch de células inteiras experimentos -clamp 18. Ao combinar a rotulagem dos poucos ou único neurônios sensoriais com in vivo lapso de tempo de imagem, é possível visualizar as conexões glomerular de simples neurônios sensoriais maduros em intervalos de tempo longos. Deste modo, também é possível acompanhar o desenvolvimento dos padrões de projeção axonal de neurônios sensoriais imaturos ao longo de várias semanas. Esta última opção é particularmente interessante, pois permite monitorar os padrões de crescimento de axônios individuais no animal vivo. Isso abre a possibilidade de investigar os mecanismos celulares e moleculares que controlam a orientação do axônio e pioneiro. Vários fatores, incluindo a expressão do receptor de odor, vários axomoléculas de orientação e n induzida por odorante / actividade espontânea de neurónios sensoriais foram mostrados para regular a constatação alvo de axónios de neurónios sensoriais 4,5. A aplicação do protocolo não está restrita aos neurónios sensoriais olfactivos, mas também pode ser aplicada ao estudo de outros tipos de células, por ex., As células estaminais / progenitoras das zonas neurogénicos do cérebro em desenvolvimento ou células mitrais do bolbo olfactivo. Além disso, a técnica demonstrada também pode ser usado em combinação com dextranos de cálcio sensíveis injectados ou corantes de cálcio permeáveis ​​à membrana para obter informações sobre o neurónio funcional marcado e / ou ligado a circuitos 7,19. A disponibilidade de uma grande variedade de fluoróforos acoplados a dextranos permite rotulagem de várias células individuais ou populações com cores diferentes. Também plasmídeo solução de ADN, por exemplo, que codifica para proteínas fluorescentes, é adequado para eletroporação e pode aumentar ainda mais a versatility e utilidade da técnica 6. O protocolo pode ainda ser melhorado para permitir a eletroporação combinado de dextrans e DNA ou morpholinos cobradas para manipular a expressão gênica 13,17. O método descrito, certamente, representa uma nova ferramenta para investigar o complexo e processos ainda não totalmente compreendidas que regulam a orientação axonal no sistema olfactivo de vertebrados.

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">SZX16</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">stereomicroscope with fluorescent illumination</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Axon Axoporator 800A</td>
			<td style="width:100px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">single cell electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">ELP-01D</td>
			<td style="width:100px;">npi electronic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">MMJ</td>
			<td style="width:100px;">M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">P-1000</td>
			<td style="width:100px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Horizontal micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">G150F-4</td>
			<td style="width:100px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 488-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 546-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22911</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 568-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 594-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22913</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">TMR-dextran 3kD (micro-Ruby)</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">microloader pipette tips</td>
			<td style="width:100px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">930001007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">anesthetic; use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">A1-MP</td>
			<td style="width:100px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">LSM 780</td>
			<td style="width:100px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Imaris</td>
			<td style="width:100px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">alternative software for neuronal tracing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

O protocolo descrito pode ser aplicado com sucesso para eletroporação e na visualização in vivo dos processos axonais de neurónios sensoriais do sistema olfactivo dos X. anestesiado laevis, usando confocal a laser de varredura ou microscopia multiphoton (Figura 1). Eletroporação permite dextrans-coupled fluoróforo para entrar e se espalhar rapidamente no interior das células do órgão olfativo. É útil para aplicar iluminação fluorescente para verificar a rotulagem bem sucedida depois de desencadeamento de impulsos de tensão. Dependendo dos parâmetros de electroporação, por ex., Resistência a pipeta, grupos de células (Figura 2A, B) ou as células individuais (Figura 2C) do órgão olfactivo são rotulados. Axónios dos neurónios sensoriais marcadas podem ser visualizadas no nervo olfactivo (Figura 2D) e os processos axonais, também pode ser observado no bolbo olfactivo, geralmente 24 horas após a electroporação bem sucedida(Figura 3). A electroporação de grupos de neurónios sensoriais permite visualizar os padrões de fiação grosseiras no bolbo olfactivo (Figura 3A). Eletroporação única célula pode ser aplicado para investigar padrões individuais axonal projeção, bifurcações axonal e conectividade para estruturas glomerulares no bulbo olfatório (Figura 3C-E). Girinos albinos transparentes de X. autorização laevis em confocal vivo ou multiphoton imagem de neurônios sensoriais marcadas no cérebro intacto de girino anestesiados. O desenvolvimento de padrões de crescimento axonal pode ser rastreado ao longo de vários dias / semanas por repetidas em visualização vivo do mesmo neurônio sensorial marcada (Figura 4). Dependendo da maturidade do neurônio sensorial no ponto de tempo de eletroporação o padrão axonal no bulbo olfatório podem variar consideravelmente. Neurônios maduros já possuem ramos axonais elaborados que apresentam tufoed áreas ligadas aos glomérulos. O padrão de crescimento axonal de neurônios maduros é bastante estável, mas o alongamento de ramos do axônio e refinamentos de tufos glomerulares são observáveis ​​(Figura 4A-E). Neurónios sensoriais pode ser observada in vivo por períodos de tempo prolongados, por exemplo., Mais longo do que três semanas (Figura 4F-I). Por outro lado, os axônios dos neurônios imaturos ainda estão em processo de crescimento inicial, não possuem arborizações tufados e ainda não ligada a suas metas finais glomerular. O protocolo experimental permite acompanhar o desenvolvimento destes neurónios durante a maturação, por exemplo., O alongamento axonal, bifurcações e estabelecimento de arborizações tufados (Figura 4J-L). Para obter mais exemplos veja também Hassenklöver e Manzini 12. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; Figura 1. Visão esquemática do protocolo experimental. (A) neurônios sensoriais no epitélio olfatório principal (MOE) ou órgão vomeronasal (OVN) do órgão olfativo de X. anestesiado larvas laevis são rotulados através de electroporação utilizando uma pipeta de vidro preenchido com uma solução de dextrano fluorescente. Os axônios dos neurônios marcados pode ser seguido através do nervo olfativo (ON) e, eventualmente, atingir o bulbo olfatório (OB). (B) O girino é anestesiado e os neurônios marcados são repetidamente investigada utilizando um microscópio confocal ou multiphoton em intervalos de tempo específicos. (C) O desenvolvimento incremental dos padrões de crescimento axonal de células marcadas podem ser acompanhados ao longo de períodos de tempo de dias ou semanas. <img alt="A Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Electroporation de neurônios sensoriais no órgão olfativo. (A) Eletroporação com pipetas de baixa resistência leva a rotulagem de várias células no órgão olfativo. Neste exemplo representativo vários neurônios olfativos receptores (ORNs, setas cheias) e duas células em forma colunar-sustentável (SCS, asteriscos) foram coradas. As linhas tracejadas demarcar fronteiras do epitélio olfactivo (OE). (B) Refinamento dos parâmetros de electroporação, por ex., Aumentando a resistência pipeta, restringe o número de células marcadas. Neste exemplo, um único neurónio sensorial (pontas de setas a cheio) e uma célula de apoio adjacente (asterisco) foram coradas após a electroporação. Observe o único axônio deixando o epitélio olfativo (setas abertas). (C) eletroporação única célula de sucesso leva a rotulagem exclusiva de um neurônio sensorial indivíduo (seta cheia) e seu axônio conectado (setas abertas) no epitélio olfatório. <strong&gt; (D) O único axônio marcada (setas abertas) pode ser seguido através do nervo olfativo (ON) para o bulbo olfativo. <img alt="A Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Visualização projeções axônio olfativos no bulbo olfativo extirpado. (A) A topologia grosseira de projeções axonais dos neurônios sensoriais no bulbo olfativo pode ser visualizado utilizando menores pipetas eletroporação de resistência. Um hemisfério bulbo olfatório e seu nervo olfativo associado (ON) são retratados. Quatro dextrans acoplados a diferentes fluoróforos foram electroporados em quatro locais distantes do órgão olfativo: lateral (verde), intermediária (amarelo), medial MOE (vermelho) e VNO (laranja). Isto permite a visualização do bulbo olfatório acessório (AOB) e os três principais campos de projeção do bulbo olfatório (MOB). <strong&gt; (B) diferentes padrões de crescimento axonal de neurônios olfatórios individuais sobrepostas na estrutura do bulbo olfatório. Descrito são combinados reconstrução tridimensional de várias colorações unicelulares derivados de diferentes amostras de larvas. (CE) Exemplos de axônios olfativos individuais projetam para o bulbo olfativo e formando arborizações tufados / sinapses em glomérulos esférica (setas cheias). Note-se que em X. laevis axônios olfativos bifurcam regularmente (setas abertas) antes de ligar para um, dois ou múltiplos glomérulos (setas cheias, veja também Hassenklöver e Manzini 12). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. In vivo de imagens de lapso de tempo de solteiro axônios dos neurônios olfativos. (AE)Após a electroporação de células individuais bem sucedida do axónio marcado pode ser visualizado repetidamente no bolbo olfactivo (OB). Este exemplo mostra um axónio individual que foi investigada para uma semana. A morfologia geral não muda consideravelmente e dois grandes pontos de ramificação pode ser identificada (setas abertas). Note-se que ao longo do tempo, um tufo glomerular sofre redução contínua (ponta de seta a cheio), ao passo que os outros dois tufos glomerulares permanecem estáveis ​​(asteriscos). (FI) Este exemplo representativo mostra a viabilidade de observações a longo prazo, pois isso axónio específica foi investigada durante mais de três semanas. Nenhuma mudança aparente do seu padrão de crescimento pode ser detectada. (JL) Um exemplo de um axónio sensorial imatura no processo de crescimento é descrita. Ele ainda não se conectou aos glomérulos e tufos glomerulares característicos estão faltando. Após 5 dias os ramos axonais são alongadas, o axônio bifurcado várias vezes e arborizações finas sãoestabelecida.

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

10.9K visualizações.  University of Göttingen. We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neurociência

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Cirurgia do nervo facial no modelo de rato para estudar inibição e regeneração axonal

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Combinando Comportamento e EEG para Estudar os Efeitos da Meditação Mindfulness na Memória Episódica

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

Otimizando a configuração e as condições do eletrorretinograma ex vivo para estudar a função da retina em olhos pequenos e grandes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...