Este protocolo apresenta um novo método para o cultivo e manutenção de culturas epidérmicas da esfera, e a estratégia de investigá-las de perto usando o ensaio de replação esferoide. Comece preparando o meio de lavagem como descrito no manuscrito do texto. Em uma capa de fluxo laminar, lave o prepúcio neonatal duas vezes com cinco mililitros de mídia de lavagem em um tubo cônico de cinco mililitros, em seguida, transfira o prepúcio lavado para uma placa de Petri estéril.
Usando um bisturi e fórceps, raspe o tecido adiposo e os tecidos conjuntivos soltos da camada dérmica, em seguida, recue o prepúcio com mídia de lavagem. Coloque o lado da epiderme prepúcio em uma placa de seis poços contendo dois mililitros de enzima Dispase diluída em mídia de lavagem. Transfira a placa para uma incubadora por quatro horas.
Após a incubação, transfira o prepúcio para uma placa de Petri e use fórceps finos para separar a epiderme da camada de derme. Coloque a epiderme em um tubo cônico de 15 mililitros contendo dois mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA. Esmague a epiderme flutuante usando uma pipeta serológica de cinco mililitros e incuba-a por 15 minutos a 37 graus Celsius com vórtice periódico por cinco segundos a cada cinco minutos.
Após a incubação, adicione dois mililitros de inibidor de trippsina de soja e misture-o por pipetação para neutralizar a trippsina, em seguida, centrífugue a suspensão celular. Resuspenque a pelota em 12 mililitros de meio KSFM-SCM completo e aplaque as células em uma antena de 10 centímetros para incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova o meio usando uma pipeta aspiradora e substitua-a por 12 mililitros de KSFM-SCM completo.
Repita isso nos dias quatro e sete. Prepare a mistura de 5% de agarose adicionando 2,5 gramas de agarose a 50 mililitros de PBS em uma garrafa de vidro de 100 mililitros. Autoclave a garrafa no ciclo líquido e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
Para preparar as placas, coloque o vidro resfriado contendo solução agarose em um copo de um litro cheio de 200 mililitros de água deionizada. Derreta a mistura de agarose em um micro-ondas de nível de pesquisa por até dois minutos, misturando a agarose a cada 60 segundos, inclinando suavemente a garrafa de um lado para o outro. Adicione três mililitros de 5%de retração derretida a 12 mililitros de KSFM-SCM pré-armados a 42 graus Celsius para uma concentração final de 1%de agarose.
Adicione 200 microliters da mistura de 1% de ágar a cada poço de uma placa de 96 poços usando uma pipetter multicanal. Em seguida, deixe a placa em um ambiente estéril a 25 graus Celsius por quatro horas. Passagem de queratinócitos humanos normais formadores de spheroid por meio de mídia aspirada e células de lavagem em dois mililitros de PBS.
Aspire PBS e adicione dois mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA às células lavadas. Em seguida, incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione dois mililitros de inibidor de trippsina de soja à placa e lave as células da placa em um tubo de 15 mililitros.
Centrifugar a 250 vezes G por cinco minutos. Resuspenque a pelota celular em um mililitro de PBS e quantifique as células usando a coloração Trypan Blue. Aliquot 20.000 queratinócitos humanos normais em 100 microlitres de KSFM-SCM e semeou as células em cada poço da placa de 96 poços previamente preparada.
Em seguida, incubar a placa durante a noite. Usando um microscópio de contraste de fase invertida, analise os poços semeados para a formação da esfera de epiderme. 24 a 48 horas após a formação da esfera de epiderme 3D, adicione quatro mililitros de KSFM-SCM pré-armados a 37 graus Celsius a um prato de seis centímetros.
Usando uma ponta de pipeta de um mililitro largo, transfira um único esferoide para a placa e incubar a placa durante a noite. Analise o esferoide semeado para fixar ou propagar células usando um microscópio de contraste de fase invertida. Alimentar células a cada 96 horas removendo a mídia e adicionando dois mililitros de mídia KSFM-SCM frescos à placa.
Passagem 70 a 80% de queratinócitos humanos normais derivados de spheroid e culturas monocamadas 2D como demonstrado anteriormente. Em seguida, quantifique a viabilidade celular usando o Trypan Blue e um contador de células automatizado. Aliquot 100 microliters contendo 100.000 a 4 milhões de queratinócitos humanos normais em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro.
Coloque os tubos no gelo em um ambiente escuro desligando as luzes brilhantes dentro do capô laminar. Adicione dois microliters de fitc-conjugado anti-integrin alfa seis e dois microliters de pe-conjugado anti-EGFR aos tubos para obter uma diluição de um a 50. Prepare um tubo sem anticorpos adicionados para servir como o controle não manchado.
Incubar os tubos no gelo no escuro por 30 minutos. Realize a análise de citometria de fluxo com lasers apropriados. Use os controles negativos e positivos para estabelecer portões.
Classifique a subpopulação da fração de células-tronco epidérmicas, a fração celular progenitora proliferativa e a fração celular progenitora comprometida. Teste para capacidade proliferativa de subpopulações celulares classificadas transferindo o conteúdo de cada tubo de triagem respectivo para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 vezes o volume de células classificadas em PBS. Centrifugar os tubos a 250 vezes G por cinco minutos.
Remova o supernatante e resuspenda a pelota em quatro mililitros de KSFM-SCM. Transfira as células resuspended para uma placa de seis centímetros e incubar durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% com 95% de umidade. No dia seguinte, remova a mídia das placas e adicione quatro mililitros de KSFM-SCM pré-armados a 37 graus Celsius a cada três dias até que 70 a 80% de confluência seja alcançada.
A capacidade autônoma de formação de esferoides epidérmicos de queratinócitos humanos normais na cultura 3D foi avaliada usando o ensaio da esfera da epiderme da pele. A agregação celular não esférica não foi considerada como formação adequada da esfera de epiderme. A agregação densa em forma de esfera foi considerada uma marca registrada da formação espontânea de esferoides.
Foi necessário usar mais de duas vezes 10 para as quatro células para garantir a agregação espontânea adequada. O plantio de esferas de epiderme na cultura 2D resultou na proliferação de um pequeno e viável queratinócitos humanos normais. É importante manter essas culturas abaixo de 100% de confluência, pois isso pode prejudicar consideravelmente seu crescimento e estado de células-tronco na cultura.
O processo de formação epidérmica de esferoides foi rastreado funcionalmente ao nível de célula única por células transfeinadas com um repórter fluorescente. Os queratinócitos humanos normais derivados de spheroid são integrin alfa seis de altura e EGF são células baixas. As células geralmente compõem cerca de 25% das culturas.
A caracterização dessa subpopulação de queratinócitos semelhante ao caule foi alcançada pela análise imunostaining da citokeratina basal 14 e da proteína tumoral 63. O ensaio de replação esferoide é uma estratégia eficaz para o enriquecimento de células-tronco epidérmicas da pele humana neonatal. Este sistema pode ser empregado como um modelo baseado em células de alto rendimento para investigar doenças cutâneas, como cicatrização de feridas e câncer.
