A transição endotelial para mesenquimal é um processo celular no qual as células endoteliais mudam sua morfologia de paralelepípedos em um fenótipo semelhante a um fibroblasto. E a citocina TGF-beta, transformando o fator de crescimento beta, é o principal motor dessa transição. A análise das mudanças na morfologia celular e dos níveis de expressão dos marcadores endoteliais e mesenquimais nos permite avaliar a ocorrência de transição endotelial à mesenquimal.
Dados emergentes ligam o processo de transição endotelial ao mesenquimal a várias doenças, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e fibrose. E os dados sugerem que a intervenção pode ser de benefício terapêutico. Estimulando o processo de transição endotelial ao mesenquimal, que ocorre durante a embriogênese e o desenvolvimento de órgãos, podemos possivelmente ser capazes de regenerar tecidos derivados de mesenquimais, como cartilagem, osso e músculo.
Para detectar a proteína intracelular por coloração de imunoflourescência, a permeabilização celular utilizando 0,1% Triton X-100 é necessária para permitir que os anticorpos passem pelas membranas celulares. Com esta demonstração de vídeo, os pesquisadores terão uma boa compreensão de como investigar o papel de citocinas como tgf-beta na transição endotelial para mesenquimal. Primeiro, sementes 1 x 10^5 espelhando células endoteliais de ilhotamo MS1 em DMEM complementadas com 10%FBS e 100 unidades por mililitro de penicilina e estreptomicina em uma placa de cultura revestida de gelatina de 0,1%.
Após a incubação durante a noite na incubadora de cultura celular, lave as células com PBS antes de tratar com dois mililitros de 0,25% de trippsina, solução 0,02% EDTA por dois minutos a 37 graus Celsius. Quando as células começarem a se desprender, sacie a reação com cinco mililitros de meio de cultura completa e transfira a suspensão celular resultante para um tubo de 15 mililitros para centrifugação. Resuspende a pelota em quatro mililitros de meio completo fresco para contar.
E sementes 1 X 10^3 células por centímetro cúbico em um novo recipiente de cultura celular. Após a cultura da noite para o dia, trate dois poços com cinco micromolar tgf-beta receptor kinase inibidor SB-431542 e dois poços com controle de solvente DMSO. E coloque as células na incubadora de cultura celular por 30 minutos.
No final da incubação, trate dois poços com controle de veículos e dois poços com TGF-beta 2. Após três dias, use um microscópio invertido para examinar a morfologia celular de cada grupo de tratamento celular sob imagens de campo brilhante. Para avaliar as alterações de marcadores relacionadas ao TMT por coloração imunofluorescente, retire as células de uma cultura celular MS1 apropriada, como demonstrado.
E semente as células em uma concentração de 1,9 X 10^3 células em 0,1% gelatina revestido 12 milímetros óculos de cobertura redonda colocados dentro de poços individuais de uma placa de 24 poços. Após a cultura da noite para o dia, trate as células com um mililitro de nanograma de TGF-beta 2 por três dias. Ao final da incubação, lave as células com PBS e fixe as culturas tratadas com 300 microlitrais de 4% de formaldeído por poço por 10 minutos à temperatura ambiente.
No final da fixação, lave as células três vezes com PBS antes de permeabilizar as células com 300 microliters de 0,1%Triton X-100 e PBS por poço por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células três vezes em PBS e bloqueie as células com 3%de BSA na PBS. Após 45 minutos em temperatura ambiente, rotule as células com anticorpos PECAM-1 e SM22 alfa primários por 45 minutos em temperatura ambiente, seguidas por três lavagens em PBS.
Após a última lavagem, incubar as células com os anticorpos secundários apropriados por 45 minutos à temperatura ambiente, e lavar as células três vezes com PBS antes de montar as células com um meio de montagem suplementado pelo DAPI e um deslizamento de cobertura. Em seguida, sele as bordas da tampa escorregar com esmalte de unha transparente e imagem a expressão do marcador celular por microscopia confocal fluorescence usando os filtros apropriados de acordo com protocolos de imagem padrão. Após três dias de tratamento com TGF-beta 2, as células Endoteliais MS1 perdem sua estrutura semelhante a paralelepípedos e se diferenciam em células mesenquimais em forma de fuso.
Esta diferenciação induzida pelo TGF-beta 2 é suprimida quando as células são expostas ao inibidor de quinase do receptor TGF-beta SB-431542. A expressão da proteína endotelial PECAM-1 é robustamente diminuída após a estimulação TGF-beta 2, enquanto o fator mesenquimal SM-22 alfa é profundamente regulado. Além disso, o Caracol é marcadamente regulado pela exposição TGF-beta 2, enquanto a expressão de lesma não é afetada.
Como observado, a edição de genes CRISPR-Cas9 pode ser usada para facilitar a introdução de dois RNAs de guia único caracol independente em células MS1 expressas cas9 para interromper a expressão de caracol. O nocaute de Caracol é suficiente para inibir a morfologia celular semelhante ao fibroblasto impulsionada pelo TGF-beta 2 em células MS1 e para bloquear o declínio PECAM-1 mediado tgf-beta 2 e o aprimoramento alfa SM-22. A avaliação das alterações na morfologia celular e na expressão de marcadores endoteliais e mesenquimais por imunofluorescência pode ser validada medindo ainda mais a expressão desses marcadores sobre PCR quantitativo na análise de manchas ocidentais.
Essa técnica de detecção da transição endotelial à mesenquimal permitiu que os pesquisadores investigassem essa significância emergente como um processo fisiológico que ocorre em múltiplas doenças.
