Este protocolo descreve a preparação da amostra e a redução de dados necessárias para estudos bem-sucedidos de eco de spin de nêutrons de flutuações coletivas de membrana de relevância para funções biológicas e aplicações práticas de membranas lipídicas. O NSE acessa diretamente a dinâmica da membrana nas escalas de tempo nanossegundos das funções-chave da membrana com a vantagem única da sensibilidade do isótopo para sondar características de membrana seletiva inacessíveis com outras técnicas. Estudos da dinâmica da membrana na nanoescala são essenciais para entender as propriedades de membrana subjacentes do mecanismo molecular e interações membrana-proteína implicadas em várias patologias celulares.
O método fornece aos pesquisadores novas para a NSE diretrizes detalhadas sobre a concepção, preparação e caracterização de vesículas lipídicas para experimentos bem-sucedidos e análise e interpretação subsequentes de redução de dados. Demonstrando o procedimento estarão Teshani Kumarage e Julie Nguyen, uma estudante de pós-graduação e estudante de graduação do laboratório. Trabalhando dentro de um capô, prepare a suspensão lipídica dissolvendo lipídios com peso preciso em um mililitro de solvente com mistura manual.
Seque a solução lipídica transmitindo suavemente um gás inerte no frasco enquanto gira lentamente em um ângulo. Para remover completamente o solvente residual, coloque os frascos durante a noite em um forno a vácuo a 35 graus Celsius. No dia seguinte, hidrate o filme lipídudo com dois mililitros de água pesada para obter uma concentração lipídica de 50 miligramas por mililitro e vórtice a suspensão lipídica hidratada até que o filme lipídudo seja totalmente dissolvido.
Em seguida, realize cinco ciclos de congelamento armazenando o frasco de suspensão lipídica hidratada a menos 80 graus Celsius até congelar. E depois transferi-lo para um banho de água de 35 graus Celsius para descongelar a suspensão lipídica. Vórtice a suspensão descongelada até ficar homogênea antes de prosseguir para o próximo ciclo.
Antes de iniciar o experimento, monte a configuração extrusora usando uma membrana poli-bicarbonato entre dois suportes de membrana e adicione dois filtros de papel em cada lado para fornecer suporte adicional. Use seringas de vidro herméticos para hidratar a membrana de policarbonato passando 0,3 mililitros de água pesada através do conjunto da membrana várias vezes. Depois de hidratar a membrana, insira uma seringa de um mililitro com uma solução lipídica de cor branca leitosa preparada em uma extremidade e uma seringa vazia na extremidade oposta do aparelho extrusor.
Uma vez que as seringas estejam conectadas, coloque a montagem no bloco de extrusora. Programe a bomba segurando o botão Taxa para inserir a taxa de extrusão e pressione o botão Diâmetro para digitar o diâmetro da seringa. Em seguida, pressione Retire até que a luz se acenda.
Pressione o início e aguarde que a amostra comece a ser distribuída na seringa vazia. Aperte o botão Parar pouco antes da seringa de amostra estiver totalmente vazia. Grave o volume dispensado e mantenha o botão Classificar até que a fase um apareça na tela.
Mantendo a luz retirar, pressione o botão de volume para inserir o volume dispensado registrado anteriormente. Pressione novamente o botão Classificar e use a seta mais alta para acessar a fase dois. Pressione o volume para inserir o mesmo valor do volume dispensado registrado anteriormente.
Nesta fase, pressione o botão Retirar até que a luz retirar esteja acesa. Repita o ciclo para a fase três pressionando o botão de volume até que o LP:SE apareça na tela e ajuste-o para 20. Por fim, pressione o botão Classificar, acesse a fase quatro e aperte o botão de volume para chegar à função Stop para terminar a configuração da bomba.
Depois que a bomba estiver programada, pressione Comece a iniciar o ciclo de extrusão. Realize de 15 a 20 ciclos de extrusão antes de coletar a suspensão lipídica transparente do opala em um frasco limpo para medições. Abra o software DAVE e selecione reduzir os dados NSE do menu De redução de dados.
Carregue os arquivos de dados sobre diferentes valores Q usando os Arquivos de eco Aberto do menu de arquivos. Os arquivos carregados aparecerão sob os conjuntos de dados disponíveis. Clique com o botão direito do mouse no arquivo selecionado e rotule-o de acordo com a medição que corresponde a amostra, celular ou resolução.
Usando a guia Data Set, agrupar os pixels do detector em 2 X 2 para melhorar a relação sinal/ruído. Aplique o mesmo binning a todos os arquivos de Resolução, Célula e Amostra. Inspecione os dados sobre todos os grupos de pixels e mascara aqueles com sinais ruins pressionando a tecla End no teclado.
Pressione Enter para acessar uma janela pop-up para aplicar a mesma máscara em todos os quatro de seus tempos. Pixels mascarados ficarão verdes. Certifique-se de que os dados coletados estão na forma de um sinal de eco.
Comece a encaixar o arquivo de resolução da lista de arquivos carregado clicando com o botão direito do mouse no arquivo desejado e selecionando Operações de ajuste, ajuste de resolução echoes no menu pop-up. Certifique-se de que os ajustes dos sinais de eco produzam parâmetros razoáveis de montagem. Para inspecionar o erro associado a cada parâmetro de montagem sobre todo o detector, selecione Opções de imagem e selecione o parâmetro de interesse de montagem.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse na imagem do detector para acessar uma janela pop-up mostrando um mapa da barra de erro. Se o ajuste sobre um pixel específico for insatisfatório, reequiba o sinal sobre esse pixel selecionando-o, pressionando a guia Encaixe e pressionando o Fit Pixel. Insira novos parâmetros de partida para a fase e período na guia Encaixe.
Reduza o arquivo de amostra selecionando o arquivo correspondente da lista de arquivos carregado e rotulado. Inspecione todos os pixels e mascara os pobres como descrito acima. Em seguida, clique com o botão direito do mouse no arquivo e selecione Operações de ajuste, fases de importação.
Para o arquivo de resolução, encaixe sinais de eco conforme descrito anteriormente com os valores do período inalterados e o ponto de fase de eco importado da resolução se encaixa. Insira o centro de feixe para todos os arquivos de dados acessando a guia Geral e inserindo os valores do centro de feixe X e Y registrados a partir do experimento. Uma vez que os ajustes estejam concluídos, calcule a função de dispersão intermediária normalizada clicando apenas no arquivo de amostra desejado da lista de arquivos instalados e selecionando Calcular I de Q no menu pop-up.
Digite as informações necessárias para a resolução e arquivos de células e o número de arcos Q na janela pop-up e pressione OK para visualizar os resultados. Observe que os dados em ciano mostram um sinal ruim devido aos efeitos da borda do detector e devem ser eliminados ao compilar diferentes conjuntos de dados Q. Finalmente, salve os conjuntos de dados reduzidos como arquivos ASCII e salve toda a sessão como um projeto DAVE na pasta desejada.
Neste estudo, foram realizadas as medições NSE de amostras lipoesômicas preparadas com diferentes esquemas de deuteração. As medidas NSE das flutuações de dobra de membrana são realizadas em lipossomos totalmente contrastados. Este esquema de deuteração resulta em uma grande diferença de comprimento de dispersão entre o núcleo da membrana e o ambiente fluido deuterado, melhorando significativamente o sinal de dispersão das membranas liposômicas e melhorando as estatísticas de medição da dinâmica de dobra.
Por outro lado, as medidas nse das flutuações de espessura da membrana de lipossomos mostram desvios relativos ao Q para a terceira dependência de flutuações de dobra. Para isolar o sinal de flutuação de espessura, o sinal obtido é dividido por Q para o terceiro e a dinâmica em excesso é encaixada a uma função Lorentzian em Q.Este método depende de dados de boa qualidade, que é mais alcançável com amostras de altas concentrações e fortes sinais de dispersão. A dinâmica sondada pela NSE pode ser explorada sinergicamente por relaxamento de deutério NMR e simulações molecular-dinâmicas para ilustrar como estruturas lipídicas moleculares e motivos de embalagem influenciam as funções da membrana.
Estudos da NSE sobre membranas lipídicas lançam uma nova luz sobre a biofísica da membrana, as intrincadas relações da estrutura e dinâmica da membrana, e como elas afetam as funções da membrana e as interações membrana-proteína.
