O melhor princípio da espectroscopia de correlação da fluorescência, FCS, foi inventado inicialmente na década de 1970. Na década de 1990, importantes e muitas melhorias para a FCS foram estabelecidas pela combinação com uma microscopia de aparelho confocal. Desde então, a FCS tem sido usada para muitas aplicações químicas e de cura de vírus, como interações moleculares e análise de agregação de proteínas.
A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativos. Brilho de fluorescência são partículas únicas em ação de tamanhos moleculares explicados por propriedades de difusão. É muito importante medir agregações proteicas porque pode determinar ciclos de vida projetados de moléculas, mas também distinguir a polimerização homo ou hetero.
Aqui, introduzimos um procedimento para medir a difusão da esclerose lateral amiotrófica associada à proteína de forma agregada utilizando FCS em células lísatos e células vivas. Prepare 100 milímetros de prato plástico cultivando células Neuro2a sentadas confortavelmente no meio de crescimento normal. Confirme a confluência celular.
Remova o meio. Adicione 3,5 mililitros de solução Trypsin-EDTA no terceiro prato de cartucho e incuba-os a 37 graus celsius por um minuto. Adicione 9,5 mililitros de crescimento normal no prato e suspenda-os.
A suspensão celular é misturada com azul trypan para manchar as células mortas. Adicione suspensão ao slide de contagem de células. Conte o número de células usando o contador de células, ou manualmente.
Verifique o número do celular ao vivo e sua viabilidade. Diluir a célula no meio contado em 1,0 vezes 10 para a potência de 5 por mililitro. Adicione dois mililitros de suspensão celular na antena plástica de 35 milímetros para lise celular ou prato de espaço de crescimento para medição de células vivas.
Incubar o prato a 37 graus celsius por um dia. No dia seguinte, prepare a mistura de DNA plasmídeo e os reagentes de transfecção. Adicione a mistura de transfecção ao meio contado por células e incubar as células por 24 horas.
Um dia depois. Verifique a expressão GFP usando um microscópio de rotina. Você pode ver os corpos de ingredientes TDP25 muito brilhantes nas células.
A lise celular deve ser realizada no banco bioquímico. Retire o meio no prato. Adicione dois mililitros de PBS a 25 graus celsius para lavar como meio.
Remova o PBS. Coloque o prato em uma placa de alumínio no topo do gelo esmagado. Imediatamente, adicione o tampão de 200 microliter lysis no prato.
Raspe o prato usando um raspador de células. Recupere o lise com detritos celulares não resolvidos em um novo tubo de 1,5 milímetros. Centrifugar o lise a quatro graus celsius.
Para medições de células vivas, substitua o meio por um fresco antes da medição. Verifique o acessório da célula usando um microscópio de contraste de fase. Além disso, verifique a expressão GFP usando um microscópio de fluorescência.
Use um sistema FCS combinado com microscópio confocal. Ligue o laser de 488 nanômetros. Estabilize o sistema, pelo menos, por 30 minutos.
Configure o caminho óptico. Use um laser de 488 nanômetros para a luz instantânea. Use um divisor de vigas apropriado e medidoresdicróicos.
E também, fusores de fluorescência. Normalmente, usaremos câmaras de vidro para calibração e medições de soluções. Com cuidado, pegue a câmara de vidro de cobertura.
Coloque a superfície de vidro no papel de triagem da lente. Despeje a calibração FCS. Adicione a solução Rhodamine 6G também.
Adicione a água ultrauso no objetivo. Não use o óleo. Coloque a câmara no palco do microscópio.
Mova o palco para a posição apropriada. Crie o ajuste do orifício e abra o assistente de ajuste do orifício. Monitore a taxa de contagem de fótons como movimento grosseiro do pinhole para a direção x.
A posição mais brilhante foi justamente determinada. Em seguida, monitore a taxa de contagem de fótons como movimento fino. A posição mais brilhante foi determinada com sucesso Esta é a posição pinhole para x-direção.
Da mesma forma, procure a posição mais brilhante do pinhole para y-direção. A posição mais brilhante para a direção y também foi determinada com sucesso. Compondo a posição x e y do orifício.
É melhor ajustar a posição do orifício antes da medição de cada dia. Quando o caminho ao vivo é alterado, a posição do orifício deve ser ajustada novamente. Crie uma taxa de contagem e monitore a taxa de contagem de telefones.
Altere para o modo de monitoramento do CPM. Conte o anel de correção do objeto que você executou para que o valor do CPM seja o mais alto. Feche a janela de taxa de contagem.
Comece com a medição da solução Rhodamine 6G. Após a conclusão da medição, clique no ajuste para realizar a Análise de Montagem da Curva. Selecione um modelo para montagem da antiga função de correlação.
Para Rhodamine 6G, selecione o modelo para difusão tridimensional de 1 componente com um estado trigêmeo. Ajuste o tempo de início de montagem movendo a linha vermelha. Clique em Encaixar Tudo, para iniciar o cálculo de encaixe.
Verifique o desvio de ajuste. Certifique-se de que os lados estão postados e negativos, em torno de zero. Verifique os valores ajustados.
Certifique-se de que o tempo de difusão esteja aproximadamente na faixa de 20-30 microsegundos. Além disso, o parâmetro estrutural é de quatro a oito. Abra o painel de ajuste e selecione um modelo para a medição.
Digite o mesmo valor de parâmetro estrutural no modelo para a amostra no painel de ajuste. Certifique-se de que o tipo deve ser definido como Fixo. Medição GFP-TDP25 em lise celular.
Coloque o lise na câmara de vidro de cobertura. Coloque a tampa para evitar secar o lise. Coloque a tampa do palco para sombreamento leve.
No painel de aquisição, defina a potência do laser, o tempo de medição e suas repetições. Comece a aquisição. Um pico foi observado.
Um pico foi observado novamente. O pico indica moléculas brilhantes passadas pelo corpo de detecção. Picos indicam oligômeros solúveis ou agregados.
Crie um ajuste para realizar a análise de ajuste de curva. Selecione o modelo para difusão tridimensional de 2 componentes com estado trigêmeo. Ajuste a hora de início da montagem.
Clique no Fit All. Verifique os valores ajustados. SOD1-G85R marcado com medição GFP em uma célula viva.
Ao contrário da medição da solução, recomendo o uso da incubadora do estágio de calor. Coloque o prato de cultivo de células no estágio do microscópio. Confirme o foco e a posição usando o ocular.
Selecione uma célula de medição. Zoom-in e ajuste a posição da célula usando um modo de varredura rápida. Adquira o instantâneo das células usando o modo de velocidade de varredura lenta.
Selecione uma posição de medição FCS usando a ferramenta Posição. A mira indica a posição de medição. Comece a medição.
A ligeira diminuição do registro da taxa de contagem de fótons sugere fotobleaching de GFP. Realize o encaixe da curva. Resultados representativos de GFP-TDP25 no lysate celular são mostrados.
O gráfico superior um registro de taxa de contagem de fótons. Onde há flechas é um pico, sugerindo oligômeros solúveis e agregados. O gráfico médio representa a antiga função de correlação.
A linha cinza mostra a função de correlação baixa e antiga. A linha magenta mostra a função instalada. As linhas pontilhadas indicam os tempos de partida e fim para a montagem.
A tabela inferior mostra o valor ajustado. Em seguida, resultados representativos de SOD1-G85R-GFP em uma célula viva são mostrados. O gráfico superior representa um registro da nossa taxa de contagem de fótons.
Observou-se a diminuição gradual da taxa de contagem de fótons registrada, sugerindo fotoblema do crescimento do GFP para diferentes medições. Isso é por causa da velocidade de difusão lenta em células vivas. O gráfico médio representa a antiga função de correlação do SOD1.
A linha cinza mostra a função de correlação baixa e antiga. A linha magenta mostra a função montada. As linhas pontilhadas indicam os tempos de partida e fim com a montagem.
A tabela inferior mostra valores ajustados. Aqui mostramos este procedimento para medir a difusão de cada célula associada ao TDP-25 em lise celular e tudo o que é mutante de SOD1 em células vivas usando FCS. Os oligômeros solúveis e a agregação no lysato celular podem ser frequentemente observados como picos ou rajadas.
Por outro lado, em células vivas, tais picos raramente são observados, exceto por estruturas vivas possivelmente óbvias. Uma espécie de SOD1 mutante adiciona brilho médio para partículas únicas como a homopolimerização SOD1 dentro para nós. O procedimento aqui mostrado é simples e vale a pena.
FcS não contém radiação;estado diretamente adormecido. É só sua empatia e imaginação.
