Agradecemos Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross para ajudar com a microfluídica e Alessia Tempestini para obter ajuda com a preparação da amostra. Esta pesquisa foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de subvenção n ° 284464 e do Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro em Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e no âmbito da Projeto Nanomax Flagship.

1 Pinças Ópticas instalação com nanômetro Estabilidade A configuração experimental deve fornecer duas pinças ópticas com apontando estabilidade a nível nanométrico e intensidade flutuações do laser de aprisionamento abaixo de 1%. Combinação dessas condições vai garantir estabilidade nanômetros do haltere sob tensão normal (1 PN - algumas dezenas de pn), rigidez armadilha (0,1 PN / nm) e largura de banda de medição (taxa de aquisição de imagem de 20 seg -1). Um esquema da montagem experimental é mostrada na Figura 1. <ol><li> Projeto pinças ópticas e de construção 15,17: <ol><li> Monte o aparato experimental em uma mesa óptica com isoladores de ativos para reduzir as vibrações mecânicas. Montar a estrutura microscópio sobre isoladores elastoméricos para absorver o ruído acústico e ressonâncias mecânicas da estrutura microscópio. </li><li> Inserir um isolador óptico no percurso do laser aprisionamento, perto da fonte de luz laser, para reduce flutuações de amplitude aleatórias devido a realimentação óptica. </li><li> Reduza o comprimento do caminho do laser armadilhas, tanto quanto possível e coloque todo o caminho em uma caixa selada para reduzir as flutuações do laser apontadores devido às correntes de ar e turbulência. </li><li> Criar pinças ópticas duplas dividindo uma única fonte de laser infravermelho próximo (Nd: YAG, 1064 nm de comprimento de onda) em dois feixes com polarizações ortogonais. Não use armadilhas compartilhada em tempo, pois causam oscilação do haltere sob tensão 12. </li><li> Use defletores óptico-acústico (EDAO) impulsionado por sintetizadores digitais Diretos (DDSS) para permitir movimentos finos de (pelo menos) uma armadilha e regulação precisa da tensão DNA. DDSs permitir uma melhor estabilidade armadilha de osciladores de tensão controlada (VCOs). </li><li> Inserir dois fotodiodos detector quadrante (QDPs) no plano focal posterior do condensador para detectar a posição dos grânulos presas com precisão sub-nm. </li></ol></li><li> Verifique se a intensidade fluctuations do laser de aprisionamento na entrada microscópio são inferiores a 1%, utilizando um fotodiodo, com uma largura de banda maior do que a taxa de aquisição de imagem. </li><li> Verifique apontando estabilidade dos dois lasers de captura: <ol><li> Preparar grânulos de sílica em tampão fosfato: Diluir 20 uL de esferas de sílica (1,54 ^ M, 10% de sólidos) em 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, vortex brevemente, e centrifugar 2 min a 19.000 x g. Ressuspender em 1 ml de acetona e lavagem repetida. Ressuspender em 1 ml de tampão fosfato 50 mM, lavar duas vezes, e finalmente ressuspender em 100 ul de 50 mM de tampão de fosfato. </li><li> Calibrar pinças ópticas com contas de sílica: preparar uma célula de fluxo, anexando uma lamela para uma lâmina de microscópio utilizando fita dupla adesiva (cerca de 60 mm de espessura). Fluxo de 1 mg / ml de BSA e esperar 3 min. Fluxo de grânulos de sílica diluído 1/1000 em tampão de fosfato e vedar a câmara de fluxo com massa de silicone. Armadilha uma pérola em cada armadilha e calibrar as armadilhas, utilizando o método de espectro de potência 18. </li&gt; <li> Preparar grânulos de sílica em acetato de pentilo e nitrocelulose: Diluir 20 ul de pérolas de sílica (1,54 uM, 10% de sólidos) em 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, vortex brevemente, e centrifugar 2 min a 19.000 x g. Ressuspender em 1 ml de acetona e lavagem repetida. Ressuspender em 1 ml de acetato de pentilo e lavar duas vezes. Finalmente ressuspender los em acetato de pentilo com 0,1% de nitrocelulose, dissolvido em acetato de pentilo. </li><li> Espalhe 2 ul de esferas de sílica 1,54 um de diâmetro dissolvidos em acetato de pentilo + 0,1% de nitrocelulose sobre a superfície de uma lamela (24 x 24 mm), utilizando uma segunda lamela (24 x 60 mm). Fixe a lamela para uma lâmina de microscópio, usando dois pedaços de fita dupla face para criar uma célula de fluxo. Encha a célula de fluxo com tampão fosfato 50 mM e selá-lo com graxa de silicone. </li><li> Imagem de um talão de sílica em microscopia de campo claro com ampliação 2,000X. O campo de visão deve ser de 7 x 5 mm adquirido em 768 x 576 pixels, para que a imagem do grânulo tem um diâmetro de 190 pixels. Compensar desvios térmicas com um software de feedback que, tal como na ref. 17, calcula a posição xy partir do centro da imagem e z a partir dos anéis de difracção e corrige desvios que se deslocam com uma fase de piezo-nm ou melhor precisão. </li><li> Sobrepor ao centro da armadilha esquerda com o centro da pérola (os níveis de sinal xy do QDP deve ser a mesma medida durante a calibração) e medir o ruído e a sua posição de desvio padrão da QDP. Repita a medição para a armadilha direita. </li></ol></li></ol> 2. Single Molecule localização com nanômetro Precisão <ol><li> Projeto de microscopia de fluorescência e construção 15,19 <ol><li> Use uma alta eficiência quântica e CCD multiplicou-elétron para alcançar os altos índices necessários para a precisão nanométrica localização sinal-ruído. </li><li> Escolha óptica para obter uma imagem de pixel de tamanho ~ 80 nm (por exemplo, uma ampliação da imagem ~ 200X com um tamanho de pixel de câmara de 16 mm). Este é suficientemente pequena a negligenciar erro de localização devido a pixelização 8, mas suficientemente grande para recolher um número considerável de fótons por pixel. </li><li> Como fonte de excitação, que utilizam a luz do laser é não polarizada (por passagem através de uma fibra óptica não mantendo-polarização), ou polarizada circularmente (passando através de um λ / 4 waveplate) para maximizar a excitação de cromóforos únicos, independentemente da sua orientação. </li><li> Escolha filtros de banda de emissão que eficiência de corte tanto excitação e armadilhas luzes de laser. Nota: Em nossos experimentos, rotulado nossa proteína com corante Atto532 e utilizado um filtro passa-banda de emissão centrada em 600 nm com largura de banda de 100 nm. </li></ol></li></ol> 3. microfluídica Para conseguir um controlo preciso de troca de tampão e a montagem &quot;haltere&quot;, isto é, a fixação de uma única molécula de ADN entre as duas microesferas opticamente armadilhados, um fluxo laminar multicanal integrado personalizadosistema tem de ser desenvolvido. Este é composto por uma câmara de fluxo, uma pressão do reservatório e um sistema de controlo de pressão (Figura 2). <ol><li> Preparação da célula de fluxo NOTA: A câmara de fluxo usado para experiências de molécula única a interacção ADN-proteína tem de preferência quatro entradas e uma saída, para permitir que até quatro fluxos de tampão em paralelo, cada uma contendo um dos diferentes elementos necessários para a experiência: grânulos, ADN, proteína, e tampão de imagiologia por fluorescência marcado. A separação dos componentes dos canais de fluxo permite uma montagem eficiente de haltere. Além disso, o canal de imagem é útil para evitar a fluorescência de fundo, a partir de proteínas de difusão e atingir a elevada relação de sinal-para-ruído necessário para a localização da proteína de ligação a DNA com uma precisão da ordem de alguns nanómetros. <ol><li> Faça furos de 1 mm de diâmetro na lâmina do microscópio (76 x 76 x 1 mm) com um diamante-ponta, a fim de criar 4 entradas e uma saída. </li><li> Limpe ªe lâminas de microscópio com etanol e o centro da porta com o anel de vedação inserido e o anel de adesivo na corrediça circundante dos orifícios de acesso. É fundamental o uso de luvas durante este passo para evitar impressões digitais, o que pode perturbar o processo de colagem. </li><li> Fixe as NanoPorts para o slide, e colocá-lo no forno pré-aquecido a 180 ° C por 1 hora para permitir a ligação completa. </li><li> Desenhar o padrão do contorno da célula de fluxo de um pedaço de papel. Os canais devem ser ~ largura de 3 mm e corresponder à posição de orifícios na lâmina de microscópio. </li><li> Coloque o desenho por cima de dois pedaços de Parafilm e com um bisturi afiado e fazer cortes contínuos ao longo do contorno desenhada. Remova qualquer protuberância formada. Descarte a camada inferior Parafilm, que é usado apenas para garantir um suporte limpo. </li><li> Colocar a lâmina do microscópio contendo o NanoPorts ligados de cabeça para baixo no suporte metálico. </li><li> Alinhe cuidadosamente o contorno câmara Parafilm com os orifícios, certificando-thno parafilme não obtrude as entradas e saída da câmara. </li><li> Cubra com lâminas de microscópio limpa (62 x 56 x 0,15 milímetros) e retire cuidadosamente o excesso de Parafilm torno da câmara. </li><li> Colocar dois blocos de calor, previamente aquecido a 120 ° C, na parte superior da célula de fluxo para aplicar pressão constante sobre ele. Deixe o Parafilm derreter por aproximadamente 25 min. </li></ol></li><li> Reservatório de pressão e recipientes de tampão O reservatório de pressão deve ser feita de Plexiglas (ou semelhante) e permitir a acomodação de seis recipientes de tampão. A possibilidade de dispor de, pelo menos, dois recipientes de tampão adicional melhora a flexibilidade do instrumento. Note que os recipientes transparentes e tubos ajudam consideravelmente na manipulação do sistema de fluxo e solução de problemas de bolhas de ar presas. Luer estéril e descartável seringas lock-ponta (2,5 ml), a partir do qual os êmbolos foram removidos, são recipientes tampão boas e permitem uma fácil ligação com o tubo de entrada. Certifique-se de queo volume total de fluido é pequena em comparação com o volume de ar no interior do reservatório de pressão, uma condição essencial para se obter um fluxo suave e estável. <ol><li> Conecte válvulas de corte na saída dos recipientes tampão para transformar o fluxo tampão ligado ou desligado durante os experimentos. </li><li> Montar a célula de fluxo na platina do microscópio. Ligue as válvulas de corte para as entradas de câmara de fluxo com tubos polieteretercetona (diâmetro ~ 150 um interno) e acessórios sem flange. Adicionar ~ 3 cm da tubagem de etileno propileno fluorado (~ 500 mm de diâmetro interno) como uma ligação entre o tubo e os conjuntos NanoPort da célula de fluxo. Este passo é essencial para reduzir o fluxo de tampão na câmara de entrada para evitar a ruptura da célula de fluxo ou NanoPort descolamento do vidro. O uso de tubos de grande diâmetro interno sozinho, por outro lado, iria exigir grandes volumes de amostras biológicas. </li><li> Ligue a saída da câmara de fluxo para um tubo Falcon aberto à pressão atmosférica. Estetubo serve como disposição para o buffer que sai da câmara de fluxo. </li></ol></li><li> Sistema de controle de pressão <ol><li> Construir um sistema de controlo de pressão capaz de ajustar com precisão a pressão de ar no interior do reservatório de pressão. Isto pode ser feito por meio de duas válvulas solenóides controladas por computador, que está ligado a uma fonte de pressão de 0,5 atm (compressor) e o segundo à pressão atmosférica. As válvulas solenóides são repetidamente aberto durante aproximadamente 7 mseg para aumentar ou diminuir a pressão na linha até que o valor desejado seja alcançado. NOTA: esta abordagem foi adaptada de Carlos Bustamante 20, e produz um fluxo mais suave do que usar uma bomba de seringa motor de passo 21. </li><li> Adicionar um transdutor de pressão controlada por um software de escrita à medida para monitorizar a pressão efectiva exercida sobre o reservatório de pressão. Pressões típicas de trabalho são da ordem de 20 mbar para montagem haltere e 200 mbar para lavar os componentes do sistema de fluxo. </li></ol></li&gt; </ol> 4. ADN Tailing com biotinilado Desoxicitidina trifosfato (biotina-dCTP) A molécula de DNA deve ser maior do que 1 pm a facilitar a sua extensão e sob fluxo de ancoragem para os grânulos de presas. Além disso, um ADN de comprimento vai evitar que a luz IR aprisionamento de iluminar a proteína de ligação de ADN. Isto tem uma importância especial, pois a absorção de luz IR de um cromóforo animado resulta em aumento da fotodegradação. NOTA: No presente estudo, a molécula de DNA foi de 3,7 mM de comprimento. A molécula continha três cópias do operador principal O1 e uma cópia de cada um dos dois agentes auxiliares, O2 e O3. Estas sequências foram inseridos no meio da molécula, o que resulta, portanto, aproximadamente equidistantes entre as esferas presos e raios laser infravermelhos. <ol><li> Misture 1 pmol de DNA extremidades 3 &#39;lineares com 60 pmol de biotina-14-dCTP, 4 l de 5x Terminal deoxynucleotidyl Transferase tampão (TdT) (1 ca M de potássiocodylate, Tris 125 mM, 0,05% (v / v) de Triton X-100, 5 mM de CoCl2 (pH 7,2 a 25 ° C)) e 1,5 ul de TdT e ddH2O para um volume total de 20 ul. Incubar a mistura a 37 ° C durante 15 min. Isto resultará na adição de até 60 nucleótidos por cada extremidade do ADN. Note-se que o DNA 3&#39;-saliências são atados com maior eficiência do que as extremidades de recesso ou cega. </li><li> Purificar DNA atados com colunas de spin ou fenol / clorofórmio e posterior precipitação etanol para remover CoCl 2 do tampão de reação TdT. </li><li> Após a purificação, o ADN pode ser armazenado a 4 ° C, durante várias semanas, ou a -20 ° C durante períodos mais longos, mas evitar o descongelamento repetidos e recongelação. </li></ol> 5. de marcação de proteínas com grupos tiol Atto532 Rotular através da modificação de resíduos de cisteína não deve alterar a atividade de proteínas. Para ultrapassar este problema, usamos LacI mutante, LacIQ231C, um which transporta apenas uma cisteína por monómero na posição 231 Este mutante preserva as mesmas características do tipo selvagem e as modificações químicas na posição 231 foram mostradas para não interferir com a estabilidade da proteína 22. NOTA: Nós marcado a proteína com ATTO532 maleimide. <ol><li> Certifique-se de que a proteína é dissolvida num tampão com um pH variando de 7,0 a 7,5 e com uma concentração variando de 2 a 10 mg / ml. NOTA: nestas experiências, LacI foi dissolvido em fosfato de potássio 0,3 M, glicose a 5%, pH 7,5 (tampão A). </li><li> Dissolve-se Tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP) a uma concentração final de 100 mg / ml em H 2 O. TCEP solução deve ser preparada antes da utilização. </li><li> Misturar 100 mL da proteína com TCEP e 3 ul de vórtice cuidadosamente. </li><li> Dissolve-se o corante em N, N-dimetilformamida (DMF) a uma concentração final de 10 mg / ml de trabalho em condições de pouca luz. Vortex até dissolver completamente. </li><li> Reação mix: Adicionar 33 mL de corante à proteína + TCEP e vortex cuidadosamente. Rotação rápida para recolher o máximo de solução possível. </li><li> Incubar a mistura de reacção durante 2 horas num agitador (8000 rpm) a 20 ° C (ou a 4 ° CO / N), ao abrigo da luz. </li><li> Dissolver L-glutationa reduzida (GSH) a uma concentração final de 100 mg / ml em H 2 O. Adicionar 3 mL da mistura de reacção e incuba-se com o agitador a 8000 rpm durante 15 min. GSH irá parar a reacção por bloquear a reactividade dos grupos tiol. </li><li> Purifica-se a proteína marcada usando colunas de filtração em gel, padrão de diálise ou concentradores de spin. NOTA: Nestas experiências, marcado LacI foi purificado por meio de 10 kDa concentradores de corte de rotação. <ol><li> Dilui-se a mistura de reacção com um máximo de 12 ml de tampão A, aplicá-lo ao dispositivo concentrador, e centrifuga-se que em 8000 xg, 1 hora, 4 ° C. O LacI assim marcado é concentrada até um volume final de cerca de 500 mL e o excesso de tinta passa a membrana na flow-through. Descarte o flow-through e repita o passo 5.8.1, pelo menos, três vezes. </li></ol></li><li> Dividir a proteína marcada em pequenas alíquotas e armazenam-se a -80 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido. </li></ol> 6. combinada óptica Trapping e única molécula Experimentos imagens de fluorescência <ol><li> Adicionar 1 mL de tampão A para os recipientes de tampão e aplicar pressão de 200 mbar para lavar as tubagens de ligação e célula de fluxo. Para maximizar a difusão da proteína de ligação de ADN, aqui e nos passos seguintes, Um tampão pode ser substituída com um tampão de baixa força iónica. NOTA: Nestes experimentos, foram utilizados 0,5 x TBE. </li><li> Verificar a presença de bolhas de ar, o que pode afectar a suavidade do fluxo. Um movimento suave no tubo de saída vai ajudar a eliminar as bolhas restantes. </li><li> Diminuir a pressão de 20 mbar e verificar que todos os canais e tubos estão livres de bolhas de ar eo buffer flui com velocidades semelhantes em todos os canais. </li><li>Preparar as amostras para um volume final de 300 uL: esferas de poliestireno revestidas com estreptavidina, 1,87 m; 20 pM de DNA linear, biotinilado em ambas extremidades, de acordo com o ponto 4; 300 pM de LacI tetramer marcado com Atto532 de acordo com a seção 5. </li><li> Adicionar a cada amostra para um dos recipientes de seringa, na seguinte ordem: Os grânulos no primeiro canal, o DNA no segundo terço do canal, com o tampão de imagem apenas (sistema de tampão A + eliminador de oxigénio) e a proteína marcada no quarto canal. </li><li> Ligue o fluxo em 200 na mbar durante 3 minutos para permitir que as amostras chegam no interior do canal de fluxo. Em seguida, reduzir a pressão de 20 mbar. </li><li> Enquanto a imagem do primeiro canal sob iluminação de campo claro, ligar as duas pinças ópticas e pegar um talão de poliestireno em cada armadilha. </li><li> Mova-se rapidamente para o segundo canal para evitar que outras esferas caem nas armadilhas. Note-se que a chegada do canal de ADN é facilmente perceptível pela extremidade do rebordo de fluxo. </li><li> Usando one AOD, mover uma armadilha (cordão) para trás e para a frente na proximidade do outro cordão para permitir a fixação do ADN estendido de fluxo entre as duas esferas opticamente armadilhados. Quando um haltere de ADN é formado, o talão estático começa a seguir o movimento da esfera que está activamente deslocado para trás e para a frente através da armadilha. </li><li> Mova-se rapidamente para o canal de buffer e desligar o fluxo de buffer. Realizar uma análise da curva da força de extensão de 4,23-25 ​​para verificar a presença de uma única molécula de DNA. Se mais do que uma molécula está presente (isto é, a entalpia, levantando fase da curva de força-de extensão ocorre em um comprimento mais curto do que o comprimento do contorno do DNA), descartar o haltere e começar de novo a partir do passo 6.7. </li><li> Uma vez que um único haltere DNA é obtido, ligue o fluxo de novo e mover o haltere para o canal de proteína. Mudar para a microscopia de fluorescência de campo grande para monitorar a interação do rótulo LacI com DNA. Desligue o fluxo e começar a aquisição. </li></ol>

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J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li><li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping.">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor,+single-molecule+fluorescence+imaging.">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li><li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA+with+optical+tweezers.">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li><li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization.">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li><li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers.">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Na última década, as técnicas simples de manipulação de imagem e de moléculas houve um grande progresso em termos de resolução espacial e temporal. A combinação das técnicas de manipulação de imagem e está na base de poderosos instrumentos que agora permitem o controlo das condições mecânicas de um único polímero biológico, tal como ADN, ARN ou filamentos do citoesqueleto, a localização e simultânea de proteínas individuais de interagir com o mesmo polímero . Controlando as condições mecânica...

Molécula única (SM) técnicas têm muito desenvolvido ao longo dos últimos 30 anos para responder à necessidade de superar algumas das limitações dos tradicionais, as medições da solução a granel 1-3. A manipulação de moléculas biológicas únicas criou a oportunidade para medir as propriedades mecânicas de biopolímeros 4 e controlar as propriedades mecânicas da proteína-proteína 5 e interacções proteína-ADN 6,7. Detecção de fluorescência SM, por outro lado, representa uma ferramenta extremamente versátil para estudar a actividade da proteína in vitro e in vivo, conduzindo a possibilidade de localizar e rastrear as moléculas individuais com uma precisão nanométrica. Através da montagem do instrumento de ponto de espalhamento de função para a imagem SM, na verdade, pode-se realizar com uma precisão de localização, dependendo principalmente da razão sinal-para-ruído (SNR) e atingir um limite de cerca de 8,9 um nanómetro. Estas metodologias encontrar poderosoaplicações no estudo da dinâmica das proteínas de motor, bem como dos processos de difusão subjacentes alvo em busca de proteínas de ligação de ADN. A capacidade de determinar constantes de difusão como uma função da sequência de DNA, o tempo de residência no alvo e medir com precisão o comprimento do DNA explorado durante os eventos de difusão unidimensional, representam uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de interacção proteína-ADN e para a investigação dos mecanismos de busca alvo específico. Recentemente, a combinação destas duas técnicas produziu uma nova geração de montagens experimentais 10-14, permitindo a manipulação simultânea de um substrato biológico (por exemplo, um filamento de actina ou uma molécula de ADN) e detecção / localização de um parceiro de interacção enzima (por exemplo miosina ou uma proteína de ligação ao ADN). As vantagens destas técnicas descansar principalmente na possibilidade de se exercer um controlo mecânico sobre o polímero aprisionada, assim enaBling o estudo da dinâmica de interação contra forças ou torques. Além disso, a metodologia permite a medição de reacções bioquímicas longe da superfície, evitando uma das principais limitações dos métodos clássicos SM, isto é, a necessidade de imobilização das moléculas em estudo sobre uma superfície (lâmina de vidro ou microesferas). A combinação de duas técnicas únicas moléculas requer superar várias dificuldades técnicas, principalmente decorrente das exigências de estabilidade mecânica e SNR adequada (principalmente quando houver a necessidade de localização com precisão nm) 15. Em particular, quando o acoplamento detecção de fluorescência SM com pinças ópticas, a redução do ruído e fotodegradação dos lasers infravermelhos armadilhas 16 eo controle de buffers bioquímicos para a montagem dos complexos biológicos e realização das medidas experimentais 11 são de suma importância. Aqui, descrevemos os métodos para a realização bem-sucedidamedições em uma configuração de localização trapping / SM fluorescência dupla. A metodologia é ilustrada com o exemplo da proteína do repressor da lactose (LacI), marcado por fluorescência (com Atto532) e detectada, uma vez que se liga a uma molécula de ADN (presa entre duas pinças ópticas), contendo sequências de ligação LacI específicos (isto é, os operadores). Nós demonstrar a eficácia do método em detectar a ligação de Lacl ao ADN e ao longo do seu contorno difusão no processo de busca de alvo. O método é aplicável a qualquer combinação de sequências de ADN e de proteína de ligação de ADN, bem como para outros sistemas de microtúbulos (ou os filamentos de actina e proteínas que interagem com eles a motor).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:151px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:203px;">Web Address</td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:115px;">elastomeric isolators</td>
			<td style="width:141px;">Newport</td>
			<td style="width:167px;">Newdamp</td>
			<td style="width:151px;">Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies</td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical isolator</td>
			<td style="width:141px;">Optics for Research</td>
			<td style="width:167px;">IO-3-YAG-VHP</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ofr.com/">http://www.ofr.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength</td>
			<td style="width:141px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:167px;">Millennia IR</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acousto-optic deflectors (AODs)</td>
			<td style="width:141px;">A&#38;A optoelectronic</td>
			<td style="width:167px;">DTS-XY 250</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.aaoptoelectronic.com/">http://www.aaoptoelectronic.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Direct Digital Synthesizers</td>
			<td style="width:141px;">Analog Devices</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.analog.com/">http://www.analog.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quadrant detector photodiodes</td>
			<td style="width:141px;">OSI optoelectronics</td>
			<td style="width:167px;">SPOT-15-YAG</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.osioptoelectronics.com/">http://www.osioptoelectronics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">DIO and FPGA board</td>
			<td style="width:141px;">National Instruments</td>
			<td style="width:167px;">NI-PCI-7830R</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ni.com/">http://www.ni.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Halogen lamp</td>
			<td style="width:141px;">Schott</td>
			<td style="width:167px;">KL 1500 LCD</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.schott.com/">http://www.schott.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Condenser</td>
			<td style="width:141px;">Olympus</td>
			<td style="width:167px;">U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-global.com/en/">http://www.olympus-global.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Objective</td>
			<td style="width:141px;">Nikon</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">532 nm laser</td>
			<td style="width:141px;">Coherent</td>
			<td style="width:167px;">Sapphire</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.coherent.com/">http://www.coherent.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CCD 200X and 2000X</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">XC-ST70 CE</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electron-multiplied CCD</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">C9100-13</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">piezo stage with nm-accuracy</td>
			<td style="width:141px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:167px;">P-527.2CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.physikinstrumente.com/">http://www.physikinstrumente.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Emission Filter</td>
			<td style="width:141px;">Chroma Technologies</td>
			<td style="width:167px;">600/100m</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.chroma.com/">http://www.chroma.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">silica beads (1.54 mm)</td>
			<td style="width:141px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:167px;">SS04N/5303</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bangslabs.com/">http://www.bangslabs.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">B4287</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pentyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">46022</td>
			<td style="width:151px;">Flammable liquid and vapour (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">nitrocellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8267-5EA</td>
			<td style="width:151px;">Flammable solid&#160; (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">heat block</td>
			<td style="width:141px;">MPM Instruments Srl</td>
			<td style="width:167px;">M502-HBD</td>
			<td style="width:151px;">with 2 removable blocks; preheated at 120&#176; C</td>
			<td><a href="http://www.mpminstruments.com/">http://www.mpminstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoPort assemblies</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">N-333</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">polyetheretherketone tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1535</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luer lock-tip syringes 2.5 mL</td>
			<td style="width:141px;">Terumo</td>
			<td style="width:167px;">SS 02LZ1</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.terumomedical.com/">http://www.terumomedical.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">shut-off valves&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">P-732</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">flangeless fittings&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">LT-111</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">fluorinated ethylene propylene tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1549</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:203px;">two computer-controlled solenoid valves</td>
			<td style="width:141px;">Clippard, Cincinnati, USA</td>
			<td style="width:167px;">ET-2-H-M5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.clippard.com/">http://www.clippard.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pressure transducer</td>
			<td style="width:141px;">Druck LTD</td>
			<td style="width:167px;">PTX 1400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotin-14-dCTP&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:167px;">19518-018</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)</td>
			<td style="width:141px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:167px;">EP0161</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.thermoscientificbio.com/">http://www.thermoscientificbio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO532 maleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">68499</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="157">
			<td height="157" style="height:157px;width:203px;">N,N-dimethylformamide (DMF)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">227056</td>
			<td style="width:151px;">Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C4706</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">G4251</td>
			<td style="width:151px;">Acute toxicity, Oral (Category 5), H303</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10&#160;kDa cutoff spin concentrators</td>
			<td style="width:141px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:167px;">UFC901024</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.merckmillipore.it/">http://www.merckmillipore.it/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 &#181;m</td>
			<td style="width:141px;">Spherotech, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">SVP-15-5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spherotech.com/">http://www.spherotech.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-dna interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Em uma experiência positiva, uma (ou mais) proteínas marcadas passam por ligação / desligação de difusão e / ou unidimensional ao longo da molécula de DNA (Figura 3A). A localização de proteínas ao longo da molécula de ADN permite a quantificação dos parâmetros cinéticos, como uma função da sequência de ADN. Quando são aplicadas as condições do tampão que causam a difusão 1E, é possível seguir trajectórias de proteína, e determinar, por exemplo, o coeficiente de difusão D <s...

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Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

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Biology

11.5K visualizações.  University of Florence.  Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos. 

Vídeo: Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Gerados por computador Modelo Estímulos animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The cellular mechano-sensation of extracellular mechanical stimuli is believed to be through the membrane receptors, the associated protein complex, and the cytoskeleton. Recent advances in mechanobiology demonstrate that the cell nucleus in cytoplasm itself can independently sense mechanical stimuli simultaneously. However, a mechanistic understanding of how the cell nucleus senses, transduces, and responds to mechanical stimuli is lacking, mainly because of the technical challenges in accessing and quantifying the nucleus mechanics by conventional tools. This paper describes the design, fabrication, and implementation of a new magnetic force actuator that applies precise and non-invasive 3D mechanical stimuli to directly deform the cell nucleus. Using CRISPR/Cas9-engineered cells, this study demonstrates that this tool, combined with high-resolution confocal fluorescent imaging, enables the revelation of the real-time dynamics of a mechano-sensitive yes-associated protein (YAP) in single cells as a function of nucleus deformation. This simple method has the potential to bridge the current technology gap in the mechanobiology community and provide answers to the knowledge gap that exists in the relation between nucleus mechanotransduction and cell function.

This study presents a new protocol to directly apply mechanical force on the cell nucleus through magnetic microbeads delivered into the cytoplasm and to conduct simultaneous live-cell fluorescent imaging.

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...