Com o crescente interesse no papel dos fatores celulares na infecção pelo HIV de macrófagos, desenvolvemos um sistema flexível de análise, particularmente para o SAM HG, que não é expresso em células U937. A principal vantagem do sistema é a sua flexibilidade. Uma vez configurado, ele pode ser usado para analisar uma variedade de proteínas, células ou vírus alvo.
É importante manter a saúde das células e também estar confortável com a citometria de fluxo multicolorida. Ligue o citômetro e o computador 10 minutos antes de iniciar a análise. Certifique-se de que os resíduos estão vazios e o tanque da bainha está cheio.
Em seguida, faça o login e abra o software de análise. Depois de mover o braço, tire o tubo de água. Defina a taxa de fluxo como alta e pressione prime.
Espere a luz se apagar e repita este processo mais três vezes. Coloque o tubo de água de volta e corra a uma taxa de fluxo alta por três minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo para baixa e pressione o modo de espera até a aquisição.
Selecione experimento, novo experimento e pressione OK para selecionar experimento em branco, clique com o botão direito do mouse no experimento e adicione um novo espécime. Pressione OK para o painel em branco. Clique com o botão direito do mouse para renomear com um nome apropriado e abra a amostra clicando no sinal de mais para revelar um novo tubo.
Clique duas vezes no tubo para ver as configurações do citômetro no inspetor. No menu de parâmetros, exclua os fluorocromos desnecessários, exceto o laser azul 53030 e o laser amarelo 61020. Na planilha, crie uma área de dispersão direta versus gráfico de pontos de área de dispersão lateral, histograma YFP, histograma RFP e gráfico de pontos RFP versus YFP clicando no ícone correspondente e alterando os eixos clicando no rótulo do eixo.
Carregue o controle não infectado e não transduzido e pressione executar na máquina. Em seguida, pressione adquirir no painel de aquisição. Ajuste as tensões de dispersão frontal e lateral no painel para posicionar as células no quadrante inferior esquerdo.
Dê a volta a essa população e rotule-a como P um. Clique com o botão direito do mouse nos outros gráficos e selecione mostrar P um para remover os detritos da análise subsequente. Ajuste as tensões RFP e YFP para baixo para que o pico fique à esquerda do histograma.
Carregue o controle de cor única para YFP e pressione acquire. Ajuste a tensão YFP no painel para que as células mais fluorescentes estejam dentro da faixa do detector. Em seguida, repita o mesmo para o controle RFP.
Selecione o experimento. Vá para a configuração de compensação e selecione criar controles de compensação e ok para alternar para uma planilha normal, em seguida, selecione uma planilha normal não manchada. Pressione na corrida e adquira para o controle não manchado.
Desenhe um portão P um ao redor das células intactas e registre. Retire o tubo e coloque a máquina em modo de espera. Clique com o botão direito do mouse em P um.
Clique em aplicar a todos os controles de compensação e mude para a planilha normal de RFP. Pressione a execução e registre o controle RFP de cor única e o software ligará automaticamente as células positivas. Coloque a máquina em modo de espera e repita o mesmo para o controle YFP.
Selecione experimentar, vá para configuração de compensação, selecione calcular compensação e, em seguida, clique em vincular e salvar. Alterne para a planilha global e retorne ao tubo da amostra. Adquirir as células transduzidas com SAM HD do tipo selvagem infectadas com HIV RFP, e verificar se quatro populações distintas podem ser vistas nos cantos dos quadrantes alinhados vertical e horizontalmente para YFP e RFP.
Remova o tubo e pressione standby. Recarregue a amostra não transduzida e não infectada e pressione run. No painel de aquisição, defina o portão de parada como P um e eventos para registrar 30.000 eventos.
Registro de imprensa. Repita o mesmo para outras amostras e controles pressionando o próximo tubo entre cada tubo. Renomeie os exemplos durante a execução ou pós-falcão e exporte os dados como arquivos FCS de ponto.
Abra o software e arraste todos os arquivos FCS para o painel. Selecione os controles de compensação e arraste-os para a subpasta de compensação. Clique duas vezes no tubo não transduzido e não infectado para abrir o arquivo e encaminhar a dispersão lateral versus uma dispersão lateral de um gráfico.
Selecione a ferramenta de polígono e a porta na população de células intactas, excluindo detritos no canto inferior esquerdo, e nomeie-a como células. Mova o rótulo para que ele não obscureça as células. Arraste este portão para toda a população de tubos na barra de todas as amostras.
Percorra toda a população usando os botões de seta horizontal para garantir o controle apropriado para cada tubo. Clique duas vezes nas células e ajuste os eixos para altura versus área. Selecione a única grande população usando uma porta retangular para excluir duplicatas e permitir que o software sugira nomeá-la como células únicas automaticamente.
Em seguida, arraste essa porta para todas as populações de células e verifique se o bloqueio é apropriado para todas as amostras. Selecione a população de células únicas para a amostra não infectada e não transduzida. Altere o eixo Y para laser azul compensado para YFP e eixo X para laser amarelo compensado para RFP.
Selecione a ferramenta de bloqueio do quadrante e clique no extremo superior direito da população de células negativas. Aplique este limite preliminar a todas as populações de células individuais arrastando para a porta pai na barra de todas as amostras. Se as portas do quadrante não separarem a população satisfatoriamente, paguem os quadrantes individuais usando a ferramenta de polígono.
Role até o tipo selvagem SAM HD uma única amostra para verificar o controle correto entre as células YFP negativas e positivas YFP não transduzidas. Use a visualização de contorno para discriminar as células negativas das células YFP fracas. Use a melhor divisão entre YFP negativo e positivo que é válida para todas as amostras e percorra as amostras para verificar o gating em relação à positividade do YFP.
Role até a amostra infectada por RFP de HIV não transduzida e verifique se o limite entre o RFP negativo não infectado e o RFP positivo infectado está correto. Use a visualização de contorno, se necessário, e percorra as amostras restantes para verificar se o controle é válido para todas as amostras. Cada amostra requer quatro quadrantes.
Q1 YFP positivo, Q2 duplo positivo, Q3 RFP positivo e Q4 duplo negativo. Abra o editor de tabelas e arraste as quatro portas do quadrante para o painel. Selecione para arquivar e excel na lista suspensa.
Escolha o destino do arquivo e clique em criar tabela. Salve a planilha gerada de acordo com as convenções de nomenclatura de arquivos locais. Clique no ícone do editor de layout para exportar as representações de gráficos e estratégias de gating.
Selecione cada população e arraste-a para o editor com os eixos, a rotulagem e o espaçamento necessários. Para criar um layout com os mesmos gráficos mostrados para todas as amostras na seção de lote, insira um na coluna e pressione criar relatório de lote. No menu arquivo, selecione a escala para largura e evite quebras de página.
Em seguida, salve no formato de arquivo necessário. Na planilha exportada, gere as colunas conforme descrito no manuscrito do texto. Use o software de análise de dados apropriado para calcular a média dos dados replicados para cada construção SAM HD one e calcular os valores da razão de restrição.
Gráficos representativos de YFP versus RFP foram gerados para dados ótimos e subótimos. O gráfico de dados subótimo indica que a infecção pelo HIV foi muito baixa e criou dificuldades com compensação e gating. A razão de restrição foi de 0,5, superior à razão esperada de 0,3.
Os gráficos de razão de restrição para variantes de SAM HD um em relação ao tipo selvagem e controle negativo foram gerados para os dados ótimos e subótimos. Nos dados ótimos, o tipo selvagem apresentou a restrição esperada de aproximadamente 0,2 e o controle negativo HD 206 a sete AA apresentou a razão de restrição de 1,0. A variante R372D foi significativamente diferente do tipo selvagem, mas não significativamente diferente do controle negativo e perdeu a capacidade de restringir.
Nos dados abaixo do ideal, o controle negativo se comportou como esperado, mas o tipo selvagem apresentou uma razão de restrição de 0,5 devido à baixa taxa de infecção. O R143D apresentou fenótipo intermediário estatisticamente diferente do tipo selvagem e do controle negativo. A variante G209S foi significativamente diferente do tipo selvagem, mas não significativamente diferente do controle negativo e, portanto, perdeu a capacidade de restringir.
É importante ter muitas de suas células de controle, especialmente se você é novo na citometria de fluxo. Depois disso ou em paralelo, a análise bioquímica dos mesmos mutantes pode ser realizada para formar uma imagem holística.
