A citometria de fluxo é uma técnica poderosa que permite a análise multiparamétrica de células únicas. Ele pode identificar biomarcadores de apoptose precoce e tardia com precisão e rapidez, analisando milhões de células. Múltiplas moléculas celulares são coradas e detectadas simultaneamente.
Em particular, a citometria de fluxo de bancada permite a análise e interpretação por citômetros de fluxo não especialistas. Quem demonstrará o procedimento será Esther Zhou, estudante de pós-graduação do grupo de câncer de vitamina D. Comece cultivando as culturas de células em um ambiente de CO2 umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO2.
Certifique-se de que a cultura celular seja aproximadamente 70% confluente no frasco pai antes de passar as células para experimentos. Retire o meio do balão e lave as células com PBS 1X. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina para destacar as células.
Depois que as células começarem a se destacar, neutralize a tripsina adicionando aproximadamente cinco mililitros de meio de cultura fresco suplementado com 10% de soro fetal de bezerro antes de contar as células. Células de sementes a 15.000 células por mililitro em três mililitros de meio de cultura celular em uma placa de cultura celular de seis poços. Incubar as placas de cultura durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de CO2 para permitir a fixação das células ao fundo do poço.
No dia seguinte, tratar as culturas experimentais com 100 nanogramas por mililitro de actinomicina D e os controles do meio e solvente com meio de cultura fresco e DMSO, respectivamente, por 24 horas. Retire o meio dos poços e colete o meio gasto em um tubo de 15 mililitros. Lave as células com 1X PBS.
Adicione 500 microlitros de tripsina para separar as células. Retropipetar suavemente um mililitro de meio duas a três vezes para desalojar mecanicamente as células restantes ainda presas ao fundo do poço. Adicione a solução dos poços em um tubo de 15 mililitros e, em seguida, adicione cinco mililitros de meio de cultura fresco para neutralizar a tripsina.
Pipetar 450 microlitros de reagente contendo corantes ligantes de DNA em tubo de microcentrífuga. Adicione 50 microlitros da suspensão celular ao tubo da microcentrífuga. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante cinco minutos.
Enumerar as células por citometria de fluxo. Diluir todas as amostras para uma concentração de uma vez 10 a sexta células por mililitro com meio de cultura celular antes de prosseguir para os ensaios de apoptose. Para detectar a externalização da fosfatidilserina usando uma anexina V, adicione 100 microlitros de suspensão celular em um tubo de microcentrífuga.
Para isso, adicione 100 microlitros de uma mistura 1:1 de anexina V conjugada fluorescente e reagente 7-AAD. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos, protegido da luz. Para análise da despolarização da membrana mitocondrial, comece centrifugando 100 microlitros da suspensão celular a 300 vezes G por cinco minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante.
Ressuspenda as células em um mililitro de 1X PBS. Adicionar 100 microlitros de solução corante TMRE a cada amostra e misturar a suspensão por retropipetagem suave. Embrulhe as amostras em papel alumínio limpo para protegê-las da luz e incube as células por 20 minutos em um ambiente de CO2 umedecido a 37 graus Celsius.
No final da incubação, adicione a solução de trabalho 7-AAD à amostra e misture-a. Para detectar caspase-3 e 7 terminais ativados, comece diluindo o peptídeo ligador de DNA ligado ao DEVE-ligado em DMSO para uma proporção de 1:8 com 1X PBS estéril para tornar a solução de detecção de caspase funcional. Conservar a solução no gelo ou adicionar dois a oito graus Celsius, protegido da luz.
Adicione dois microlitros de uma solução estoque de 7-AAD a 148 microlitros de 1X PBS para tornar a solução de 7-AAD funcional. Armazenar a solução no gelo ou a dois a oito graus Celsius, protegido da luz. Centrifugar 50 microlitros da célula de suspensão por cinco minutos a 300 vezes G e descartar o sobrenadante.
Ressuspender as células em 50 microlitros de 1X PBS, seguido por cinco microlitros da solução de trabalho de detecção de caspase e misturar completamente. Solte a tampa dos tubos e incube por 30 minutos em um ambiente de CO2 umedecido a 37 graus Celsius, protegido da luz. Adicione 150 microlitros da solução de trabalho 7-AAD a cada amostra e misture.
Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. Para detecção de quebras de DNA de fita dupla e danos totais ao DNA, primeiro centrifugar 50 microlitros da suspensão celular por cinco minutos a 300 vezes G e descartar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 500 microlitros de 1X PBS e adicione 500 microlitros de um tampão de fixação à base de formaldeído e misture.
Incubar as amostras no gelo por 10 minutos. Centrifugar por cinco minutos a 300 vezes G e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 90 microlitros de PBS 1X em um tubo de microcentrífuga.
Adicione 10 microlitros da solução de anticorpos ao tubo da microcentrífuga. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos no escuro. Adicione 100 microlitros de 1X PBS e centrifugar por cinco minutos a 300 vezes G.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de 1X PBS.
Misturar a amostra por meio de uma pipetagem suave antes de carregar a amostra no citómetro de fluxo. Verifique o desempenho analítico do citômetro de fluxo executando o kit de verificação do sistema do instrumento e não prossiga com amostras em execução até que todas as verificações sejam concluídas e aprovadas. Primeiro, carregue uma amostra de controle negativo no citômetro de fluxo e selecione Executar, Ajustar configurações, para que o instrumento comece a aspirar a amostra e forneça uma visualização em tempo real dos eventos detectados.
Usando a visualização ao vivo, ajuste os limites de fluorescência e tamanho da célula. Desenhe uma porta retangular ao redor da população de células, arraste o marcador de limite para excluir detritos celulares e selecione Avançar, Definir perfil de apoptose para prosseguir. Toque e arraste os marcadores de quadrante para separar as populações de células e plotar os eventos detectados em tempo real.
Use esses gráficos para orientar o usuário final sobre o posicionamento apropriado dos marcadores de quadrante. Selecione Avançar, Verificar configurações para prosseguir para que o instrumento exiba um resumo das configurações. Depois de revisar as configurações, selecione Avançar, Concluir configurações para aplicar essas configurações a todas as amostras do experimento.
Misture a primeira amostra por retropipetagem suave e carregue a primeira amostra no citômetro de fluxo. Selecione Avançar, nomeie o exemplo e selecione Executar para que o sistema comece a executar o exemplo. Se necessário, realize o ajuste fino dos portões ou marcadores de quadrante pós-aquisição.
Localize o experimento que precisa de ajuste navegando no navegador de arquivos do sistema e abra o experimento. Toque na visualização em miniatura do enredo para ampliá-lo. Para ajustar os marcadores de quadrante, clique na interseção das linhas verticais e horizontais para mover os marcadores como eles são, e ajuste o ângulo de cada linha clicando na linha e arraste a alça.
Para refinar o fechamento da célula, clique na guia Portão e ajuste as dimensões do portão. Ajuste os marcadores conforme desejado e aplique essas configurações a todas as amostras do experimento selecionando o ícone de marca de seleção, marcando todas as amostras e selecionando Aceitar. Executar testes em triplicata e executar uma análise de variância com um teste post hoc de Bonferroni para avaliar diferenças significativas entre as amostras e os controles.
Os resultados de contagem e viabilidade celular mostraram que 95,2% das células da amostra estavam vivas e 4,8% mortas. A concentração celular encontrada foi de 5,90 vezes 105 células por mililitro. A anexina V e o ensaio de morte celular mostraram um aumento significativo de células apoptóticas em células SiHa tratadas com 100 nanogramas por mililitro de actinomicina D, em comparação com os controles.
O ensaio de potencial transmembrana eletroquímico mitocondrial demonstrou uma diminuição significativa nos perfis de saúde celular entre actinomicina-D, meio controle e solvente, o que sugeriu que 100 nanogramas por mililitro de actinomicina D induziram despolarização mitocondrial em células SiHa. Os ensaios de caspase-3 e 7 demonstraram ativação significativa de caspases terminais em células SiHa tratadas com 100 nanogramas por mililitro de actinomicina D, em comparação com os controles. A actinomicina D induziu significativamente marcadores de danos ao DNA, ATM e H2A.
X em células SiHa, o que sugeriu um aumento significativo nos danos ao DNA. Para aumentar a precisão, certifique-se de colher a população total de células. Além disso, aderir às concentrações celulares recomendadas pelo fabricante e tempos de coloração.
A proteção das amostras coradas contra a luz evita o fotobranqueamento ou fluoróforos. A análise bioquímica da apoptose por citometria de fluxo deve ser apoiada por microscopia. Isto identificará características morfológicas da apoptose clássica.
As características incluem condensação nuclear, mistura de membrana celular, corpos apoptóticos e cariorrexia.
