Este protocolo é uma maneira muito simples e eficiente de detectar mutantes gerados pela tecnologia CRISPR/Cas9 de inúmeros indivíduos. As duas principais vantagens dessa técnica são que ela pode ser feita em poucas horas e que é aplicável a uma infinidade de organismos. O design primer pode ser desafiador para certos genes e várias rodadas de design e verificação de primer podem ser necessários para tornar o HRMA eficiente.
Para realizar um PCR gradiente, comece preparando uma mistura mestra. Em seguida, remova 19 microliters da mistura mestre para o controle não-modelo ou NTC em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione o modelo à mistura principal restante.
Aliquot 20 microliters da mistura de amostra na placa de 96 poços. Realize o PCR seguindo os parâmetros de ciclismo e, em seguida, gere os perfis de derretimento térmico utilizando os parâmetros mencionados no manuscrito. Depois de reunir todo o material necessário, prepare uma mistura mestre com 0,5 microliters do reagente de liberação de DNA e 20 microliters de tampão de diluição por indivíduo para ser genótipado.
Usando um pipet multicanal, aliquot 20 microliters da mistura em uma placa PCR e deixe a placa PCR no gelo. Em seguida, coloque os mosquitos G1 anestesiados em uma placa de vidro petri para mantê-los sedados e coloque oito mosquitos selvagens na segunda placa de Petri. Limpe um par de pinças com 70% de etanol e use a pinça desinfetada para remover uma das pernas traseiras dos mosquitos.
Em seguida, submergir a perna na solução de reagente de liberação de DNA. Coloque o mosquito no frasco correspondente e feche o frasco com uma esponja. Uma vez feito, limpe as pinças com 70% de etanol antes de prosseguir com a remoção da perna do próximo mosquito até que a placa de 96 poços seja concluída.
Mais tarde, sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR e incubar a placa PCR contendo as pernas em temperatura ambiente por dois a cinco minutos, seguida de incubação a 98 graus Celsius por dois minutos. Deixe a placa esfriar até a temperatura ambiente. Para PCR, prepare uma mistura mestre contendo os componentes preferidos e, em seguida, use uma pipeta multicanal para transferir 19 microliters da mistura mestre em cada poço da placa de 96 poços.
Depois de transferir um microliter da solução de liberação de DNA contendo DNA de mosquito previamente preparado para a placa, sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR. Execute o PCR com os parâmetros de ciclismo apropriados para gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros descritos no manuscrito e, em seguida, examine os perfis de derretimento atribuindo controle do tipo selvagem ao cluster de referência. Marque os diferentes clusters com cores correspondentes no modelo de 96 poços.
Em seguida, selecione os indivíduos com curvas de interesse e remova os indivíduos selecionados dos tubos para trás cruzado. O sangue alimenta as fêmeas, seguido pela coleta de G2As. Na análise representativa, mostra-se a análise sequencial do mutante ZIP11 do Aedes aegypti.
O eletroferograma do Aedes aegypti ZIP11 mutantes heterozigosos indicou a posição nucleotídea onde ocorreu o indel. O indel é representado por uma mudança de picos únicos para duplos, pois as posições polimórficas mostram ambos os nucleotídeos concomitantemente. Ao final da execução, o número de pares de base excluídos ou inseridos foi calculado contando os picos únicos.
Mosquitos contendo mutações nos genes Aedes aegypti ZIP11 e mio-fem foram genótipados e sequenciados verificados através da análise de derretimento de alta resolução do HRMA. Os sinais fluorescentes das amostras foram normalizados a valores relativos de um a zero. Além disso, cada curva foi subtraída da referência do tipo selvagem e denotou a ampliação correspondente.
Uma atribuição de cluster automático falhada é mostrada nos resultados representativos, onde uma distinção adequada entre os grupos não foi feita. Além disso, cada amostra foi analisada individualmente e atribuída aos grupos corretos com base na semelhança com amostras de heterozygotes, homozygotes e transheterozygotes. Após a realização das HRMAs, o sequenciamento do DNA dos indivíduos mutantes é necessário para analisar os indels e identificar as outras mutações na sequência alvo.
