O estudo da função genética e da doença são dificultados pela natureza desaprodução da população humana. Os diferentes antecedentes genéticos das linhas celulares iPS específicas do paciente e controlam o paciente podem afetar a eficiência de diferenciação e fenótipos encontrados em um determinado ensaio funcional. O uso de linhas geneticamente idênticas ou isogênicas onde a única diferença é a mutação particular de interesse é fundamental para superar essas questões.
Muitas doenças humanas são causadas por mutações heterozigas, que podem ser difíceis de gerar com o sistema CRISPR-Cas9. Isso se deve à geração de mutações indejadas no alelo não direcionado que podem ocorrer em uma frequência muito alta. Nossa técnica supera esse problema usando dois modelos de reparo dos quais apenas um abriga a mutação de interesse.
Qualquer investigador que experimente essa técnica deve ser hábil na cultura de células-tronco pluripotentes humanas. A demonstração de vídeo da colheita de colônias será útil para mostrar o tamanho correto e a morfologia, bem como a técnica usada para a colheita e triagem. Demonstrando este procedimento será Leo Cardenas.
Para começar, emplaque eSCs humanos em MEFs irradiados em uma placa de 6 poços. Prepare a mistura mestre de transfecção. Misture por pipetação e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, então, adicione a mistura mestre de transfecção cair sábia a cada poço com células e incubar a 37 graus Celsius por 48 horas. Mude a mídia a cada 24 horas. Para colher as células, primeiro, incubar as células com Triplo E por três minutos à temperatura ambiente para remover mefs enzimaticamente.
Adicione 0,5 mililitros de meio HESC com 10 inibidores de ROCK micromolar. Células de pelotas a 300 vezes g por três minutos e rein suspendam em 0,5 mililitros de meio ESC humano com 10 inibidores de ROCK micromolar. Filtre a suspensão celular em um tubo de cinco mililitros através de uma tampa de filtro de célula de 35 mícrons.
Usando a triagem celular ativada pela fluorescência, portal em células vivas e classificar as células verdes fluorescentes procedentes. Em seguida, transfira um máximo de 1,5 vezes 10 para as quatro células classificadas diretamente em um prato de 10 centímetros revestido com uma ou três matriz de membrana de porão e MEFs irradiados e meio ESC humano contendo inibidor de ROCHA. Mude o meio diariamente usando o meio ESC humano sem inibidor de ROCHA.
Após 10 a 15 dias, as colônias têm aproximadamente um a dois milímetros de diâmetro. Sob um microscópio, use uma pipeta P200 para raspar cuidadosamente um único clone e desenhar células na pipeta. Disperse as células em um poço de uma placa de 96 poços, cano suavemente três a quatro vezes no meio elaborado com a colônia.
Em seguida, escolha 20 colônias para cada RNA guia e dispense em tubos de tira PCR para triagem. Pelota as células por centrifugação a 10.000 vezes G por cinco minutos. Agora, incubar pelotas de células em 20 microliters de tampão Proteinase K para isolar DNA e vórtice vigorosamente.
Centrifugar a 10.000 vezes G por cinco minutos. Em seguida, realize a triagem pcr do DNA editado. Adicione aos tubos 20 microlitros de uma mistura mestre, incluindo primers dianteiros e invertidos, projetados para amplificar a região de interesse, bem como cinco microlitros do digestor Proteinase K.
Use DNA genômico isolado da linha iPSC de controle para confirmar um amplicon limpo ao realizar o PCR de triagem. Avalie as mudanças de tamanho dos produtos PCR após uma hora de eletroforese a 70 a 90 volts em um peso de 2,5% em volume de gel de agarose. Qualquer diferença de tamanho é indicativo de decote.
Para transfetar o DNA oligo de fio único e os plasmídeos CRISPR-Cas9, plaque a linha de células-alvo em um prato de 6 poços em MEFs irradiados para atingir 70 a 80% de confluência após uma incubação durante a noite. Configure a reação de transfecção como descrito. Misture a reação por pipetação e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione a mistura de reação de transfecção cair em sabedoria para as células. Depois de 48 horas, prepare as células para a classificação celular como anteriormente. Cerca de 10 dias depois de emplacar células individuais, use uma pipeta de 200 microliter para colher colônias em tubos de tira PCR e em um poço de uma placa de 12 poços pré-revestida com gelatina e MEFs.
Transfira 100 microliters das células para cada poço de uma placa de 24 ou 48 poços, previamente revestido com gelatina e MEFs irradiados em meio ESC humano com inibidor de ROCHA. Use os 100 microliters restantes para isolamento de DNA. Para verificar a integração bem-sucedida do DNA oligo de uma única cadeia, pegue cinco microlitros de DNA isolados de cada colônia para realizar PCR usando os primers de triagem previamente projetados.
Purifique os produtos PCR e prepare os 40 microliters de digestão enzimada de restrição usando o local enzimádicos único criado no DNA oligo de fio único. Misture a reação por pipetação e incubar na temperatura recomendada pelo fabricante por uma a três horas. Em seguida, visualize os produtos PCR digeridos adicionados com um corante de carga em um peso de 1,5% em volume de gel de agarose brometo de etídio, eletroforese a 80 a 100 volts por 40 minutos.
Se ocorreu uma integração bem sucedida do DNA oligo de uma única cadeia, sequencia mutações específicas usando uma cartilha aninhada. Neste estudo, para a construção do RNA guia, uma banda de 100 pares base foi extirpada de um gel de 1,5%. Após a transfecção celular, a validação do corte guia de RNA foi visualizada utilizando-se um gel de 2,5%.
Um produto PCR de par base de 180 base mostrou um controle sem cortes e diferentes clones com mudanças de banda indicando formação indeléda. Diferentes guias as RNAs tinham diferentes eficiências de corte. Para evitar o re-corte CRISPR-Cas9 dos alelos editados, a sequência PAM foi modificada usando uma mutação silenciosa G a A.
Uma mutação silenciosa na sequência PAM gerou um site de restrição único, que ajuda a rastrear a integração bem sucedida em um ou dois alelos. As linhas de células-tronco editadas pelo genoma podem ser usadas em diferenciações a jusante e ensaios funcionais para estudar o efeito de uma dada mutação no desenvolvimento humano e na doença. Essa metodologia permite a geração de linhas celulares isogênicas com mutações heterozigosas ou homozigosas específicas, implicadas em uma grande variedade de doenças humanas.
Esses modelos de doenças abrem caminho para o desenvolvimento de novas terapias celulares, bem como oferecem plataformas para a descoberta de medicamentos.
