Os protocolos são significativos, pois evitam o uso de isótopos radioativos e removem uma barreira que pode impedir muitos trabalhadores de estudar enzimas do metabolismo do glicogênio. Os procedimentos descritos são baratos, exigindo apenas acesso a um espectrofotômetro simples. Para começar com a determinação da atividade da glicogênio sintase, descongele as soluções-estoque previamente preparadas de UDP glicose, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP quinase no gelo.
Pré-aqueça um banho-maria a 30 graus Celsius. Quando as soluções-mãe estiverem prontas, preparar uma mistura de ensaio suficiente de acordo com o número de ensaios de glicogénio sintase, adicionando os reagentes a um tubo de 15 mililitros, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma reação em branco, substituindo o NADH da mistura de reação com a água e transfira a reação para uma cubeta de metacrilato descartável.
Use a reação em branco para definir zero no espectrofotômetro no comprimento de onda de 340 nanômetros. Pegue uma alíquota de 770 microlitros da mistura de reação em um tubo de 1,5 mililitro e adicione sequencialmente dois microlitros cada de mistura de NDP quinase e piruvato quinase lactato desidrogenase ao tubo. Após a mistura, incube suavemente o tubo a 30 graus Celsius no banho-maria por três minutos para pré-aquecer a mistura de reação.
Em seguida, adicione 30 microlitros da amostra contendo glicogênio sintase em tampão Tris 20 milimolares a pH 7,8 e misture suavemente antes de transferir a mistura de reação para uma cubeta de metacrilato de eliminação. Coloque a cubeta no espectrofotômetro e registre a absorvância em 340 nanômetros em intervalos cronometrados por 10 a 20 minutos. Em seguida, plote as absorvâncias obtidas em relação ao tempo.
Para medir a glicose liberada, transfira 40 microlitros do sobrenadante das amostras de glicogênio aquecido para as cuvetes de metacrilato descartáveis. E adicione os volumes medidos de trietanolamina, tampão de sulfato de magnésio cloridrato, mistura de ATP NADP e água, conforme descrito no manuscrito. Misture a mistura pipetando para cima e para baixo suavemente sem criar bolhas de ar.
Adicione 0,5 microlitros de glicose-6-fosfato desidrogenase a cada cuvete. Após a mistura por pipetagem, incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, registar a absorvância a 340 nanómetros. Em seguida, misture 0,5 microlitros de hexoquinase a cada cubeta, conforme descrito anteriormente, e incube por 15 minutos antes de registrar o conjunto absorvente de 340 nanômetros.
Em seguida, continue a incubação à temperatura ambiente por cinco minutos, seguido de registrar a absorvência. Se a absorção tiver aumentado em relação à registada aos 15 minutos, continuar a incubação durante cinco minutos antes de registar a absorção final a 340 nanómetros. Para determinar a ramificação do glicogênio, combine 650 microlitros de estoque de reagente de cor de cloreto de cálcio iodo com 100 microlitros de água em um tubo de 1,5 mililitro e misture a solução completamente antes de transferir para uma cubeta de metacrilato descartável.
Coloque a cubeta no espectrofotômetro para realizar uma corrida em um modo de varredura de comprimento de onda para coletar o espectro de fundo de 330 a 800 nanômetros. Em um tubo separado de 1,5 mililitro, combine 650 microlitros do reagente de cor de cloreto de cálcio iodo em funcionamento com 50 microgramas do glicogênio da ostra e componha o volume final para 750 microlitros com água. Depois de misturar a mistura completamente, transferir a solução para uma cubeta de metacrilato descartável para coletar um espectro de absorção de 330 a 800 nanômetros.
Da mesma forma, obtenha um espectro de absorção com 50 microgramas de amilopectina e 30 microgramas de amilose, conforme descrito anteriormente. Para obter uma indicação da estrutura ramificada de uma amostra de glicogênio não caracterizada, combine 25 a 50 microgramas do glicogênio com 650 microlitros do reagente de cor do cloreto de cálcio iodado em funcionamento e proceda como explicado anteriormente para adquirir o espectro de absorção. Nos ensaios de glicogênio sintase, observou-se uma diminuição linear na absorção em 340 nanômetros ao longo do tempo.
A adição de muita glicogênio sintase ao ensaio fez com que a reação atingisse a conclusão nos primeiros dois minutos. A reação de controle, que não continha glicogênio sintase, não mostrou diminuição mensurável na absorvência. Os dados de um ensaio de glicogênio fosforilase usando uma enzima purificada tiveram uma fase linear com duração de três minutos.
Uma taxa de aumento da absorbância de cerca de 0,01 a 0,04 unidades por minuto é ideal. No ensaio enzimático de desramificação do glicogênio, a reação mostrou uma fase linear persistente por pelo menos 10 minutos. Os dados representativos dos ensaios de enzima ramificada de glicogênio mostraram a diferença na absorvância entre as amostras de controle que não possuíam enzima ramificada e as reações que continham enzima ramificada.
A faixa dinâmica estreita do ensaio é ilustrada. A mudança máxima na absorbância que pode ser produzida é de 0,4 unidades de absorvância, e a linearidade é perdida quando a mudança na absorção é de aproximadamente 0,2 unidades de absorvância. As massas de glicogênio, amilopectina e amilose utilizadas na avaliação de ramificação do glicogênio apresentaram uma leitura de absorvância máxima de cerca de 0,7 a 0,8, cada uma em diferentes máximos de absorbância.
A amostra de glicogênio produziu dois picos em aproximadamente 400 nanômetros e 460 nanômetros. O reagente de cor do cloreto de cálcio iodado é muito denso. É importante garantir que as amostras de glicogênio sejam totalmente misturadas com o reagente antes de coletar um espectro de absorção.
