Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais de combinação oral, ou TARV, que suprime com sucesso a replicação do RNA do HIV em camundongos humanizados. O novo método de TARV oral supera as tentativas de parto anteriores devido à sua segurança, facilidade de preparação e administração e redução do estresse animal resultante de uma injeção diária. O método de entrega oral proposto para suprimir a replicação do RNA do HIV em camundongos humanizados será altamente valioso para estudos pré-clínicos de prova de conceito para desenvolver novos tratamentos de cura que imitem de perto a administração de medicamentos em indivíduos crônicos infectados pelo HIV.
Demonstrando o procedimento estará Valerie Rezak, gerente de laboratório e técnica do nosso laboratório. Comece pesando drogas individuais. Faça 10 copos de alimentos com cART usando raspadores de células estéreis para pesar 250 miligramas de FTC, 375 miligramas de TDF e 500 miligramas de RAL ou ELV em tubos de centrífuga individuais e estéreis de 50 mililitros em um gabinete de biossegurança.
Adicionar DMSO ao tubo FTC e TDF para formar uma concentração final de 250 miligramas por mililitro, e no tubo RAL ou ELV a uma concentração final de 500 miligramas por mililitro. Misture a solução do medicamento agitando e pipetando até que uma solução clara seja obtida. Esterilizar as soluções utilizando um filtro de membrana de PVDF hidrofílico de 0,22 micrómetros com uma seringa estéril.
Soluções medicamentosas individuais podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por 12 semanas. Descongele recentemente uma alíquota de cada solução medicamentosa antes do uso a 37 graus Celsius até que a solução fique clara. Misture bem usando uma pipeta.
Combine os medicamentos dissolvidos em DMSO e misture bem para compor uma mistura mestra contendo um mililitro de FTC, 1,5 mililitros de TDF e um mililitro de ELV ou RAL. Adicione 350 microlitros de solução de mistura mestre cART em um copo para preparar um copo de gel diet boost cART. Adicione 0,75 mililitros de trimetoprim sulfametoxasol no copo.
Mexa bem usando pontas de pipeta estéril de um mililitro. Usando uma ponta de pipeta, alíquota do copo de comida contendo cART em uma placa de Petri de 60 milímetros. Calcule a quantidade de cART no copo de comida pesando o alimento para cada gaiola de acordo com o número de camundongos.
Remova a ração regular da gaiola e substitua-a por um copo de comida contendo cART. Atualize a comida cART três vezes por semana. Pesar copos usados para monitorar a ingestão.
Em seguida, pese os ratos semanalmente para confirmar o consumo. Após quatro semanas de infecção pelo HIV-1, os camundongos foram tratados por mais 7,5 semanas, seja com o regime FTC/TDF/RAL por injeção subcutânea ou pela administração oral de FTC/TDF/RAL ou FTC/TDF/ELV. O peso do rato diminuiu continuamente durante a injeção subcutânea diária de cART.
Em contraste, o gel dietético restaurou os pesos dos ratos aos níveis de iniciação pré-TARV após cinco semanas de administração oral de TARV. Além disso, não foram observadas alterações significativas de peso entre os grupos RAL ou ELV. Dentro de quatro semanas, o regime alimentar FTC/TDF/ELV e RAL/ART suprimiu a replicação viral em 100% e 80%, respectivamente.
70% dos ratos que receberam injeção de SC atingiram níveis indetectáveis após quatro semanas de tratamento. Os resultados confirmaram que a administração oral suprimiu a replicação viral de forma mais rápida e eficiente do que as injeções subcutâneas. Além disso, o regime alimentar de cART impediu o declínio adicional das proporções de CD4 para CD8 no sangue periférico mais cedo do que as injeções diárias.
É fundamental manter a esterilidade de qualquer material envolvido no protocolo durante todo o processo e evitar o congelamento e descongelamento múltiplos da solução de estoque de cART.
