HIV-1 desencapsulamento estudos em laboratório Aiken foram apoiados pelo NIH concede AI40364, AI50423 e AI076121. Vários materiais-chave, incluindo reagentes utilizados na ELISA p24, foram fornecidos pelo NIH AIDS Programa de Pesquisa e Referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH.

1. Produção de partículas de HIV-1 Antes de prosseguir, você deve obter a permissão e siga as orientações do escritório de Biossegurança da sua instituição para trabalhar em uma instalação de biossegurança aprovado para HIV infecciosas. Você deve garantir que a atenção adequada e precauções de segurança são seguidas durante a trabalhar no laboratório de biossegurança. Produção de partículas de HIV-1 é normalmente realizada por transfecção transiente de células 293T com HIV-1 DNA proviral utilizando um método de transfecção de fosfato de cálcio 7, 8. Estoques altos títulos de vírus cresceu em cultura de células T infectadas também são adequados. <ol><li> Cultura 293T células Modified Dulbecco Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e suplementadas com antibióticos [penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 mg / ml)], a 37 ° C CO, 5% 2 . </li><li> Separar células de pratos quase confluentes com 0,25% tripsina-EDTA e sementes de 2x10 6 </sup&gt; células em 9 ml por 100 milímetros placa de cultura um dia antes de transfecção. Semente de seis placas de cultura de 100 milímetros para a produção de virions. Se a preparação concentrada de núcleos é necessário, pratos mais poderia ser semeado de transfecção. </li><li> No dia seguinte, a monocamadas de células deve ser de cerca de 25% confluentes e pronto para transfecção. Por seis pratos de células a serem transfectadas, trazer 120 mg de DNA proviral até um volume de 2,7 ml com água estéril. Para esta mistura adicione 0,3 ml de 2,5 M CaCl 2 e 3 ml de 2XBBS, e misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10-20 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml da mistura resultante gotas para o centro de cada prato enquanto agita suavemente para misturar. Coloque os pratos durante a noite (~ 16 horas) em um conjunto de incubadora a 35 ° C e 3% CO 2. </li><li> Aspirar o meio de cultura e gentilmente adicionar 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar PBS e adicionar 5 ml de meio fresco. Cultura das células na incubadora a 37 edeg; C e 5% de CO 2 para adicional de 24-48 horas. </li><li> Recolher o sobrenadante de cultura contendo partículas virais, transferi-lo para um tubo de centrífuga 50 ml. Combine os sobrenadantes de todos os pratos e centrifugar a 1.500 xg por 5 min para as células pellet e detritos. Filtrar o sobrenadante usando 0,45 mM filtros de poros de tamanho da seringa. Devem ser tomadas precauções para minimizar a formação de aerossóis durante o trabalho com o vírus vivo. Isso inclui o uso de tubos cônicos com O-rings ou tampas balde rotor durante a etapa de centrifugação. Se isso não for possível, as tampas dos tubos deve ser envolvido com parafilme. </li></ol> 2. Concentração de HIV-1 virions por ultracentrifugação <ol><li> Coloque o sobrenadante da cultura (30 ml) em um tubo de centrífuga 38,5 ml polyallomer (para rotor Beckman SW32Ti ou equivalente). Suavemente underlay o sobrenadante contendo vírus com 5 ml de solução de sacarose 20% em PBS usando uma pipeta de 5 ml. </li><li> Centrifugar por 3 horas a32.000 rpm a 4 ° C (175.000 xg em r max) de partículas do vírus da pelota. </li><li> Retire o sobrenadante por aspiração, tomando cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo. Adicionar 0,5 ml de tampão 1XSTE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) para o tubo e colocar a 4 ° C por 1 hora para soltar o pellet. Usando um wide-bore uma ponta da pipeta pipeta suavemente ml cima e para baixo algumas vezes para retirar o sedimento do fundo do tubo. Em seguida, transferir o pellet afrouxou a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, tendo o cuidado de evitar a formação de espuma. Incubar a 4 ° C por mais de 1-3 horas para permitir que os pequenos aglomerados de vírus para dispersar. Durante esse período, prepare o gradiente de sacarose como descrito no passo 3.1. </li><li> Pipeta suavemente a suspensão de vírus para cima e para baixo várias vezes e centrifugar a 8.000 rpm (6.000 xg) a 4 ° C em microcentrífuga refrigerada por 1 min para remover aglomerados residual. Manter o frio da amostra durante este processo. </li></ol> 3. Gradiente de sacarosecentrifugação para isolar núcleos HIV-1 núcleos estão isolados utilizando um &quot;spin-thru&quot; método 9, que é uma modificação do método descrito anteriormente para a purificação de HIV-2 núcleos 10. <ol><li> Prepare um gradiente de sacarose 12 ml linear de 30% a 70% em tampão 1XSTE em um tubo de centrífuga 14,5 ml polyallomer para SW32.1Ti rotor. Para preparar gradiente, use um gradiente de 20 ml anterior; lugar 6 ml da solução de sacarose 70% no lado mais próximo (perto da porta de saída) e 6 ml da solução de sacarose 30% do outro lado. Certifique-se que as bolhas de ar não são presos no canal que liga as duas câmaras. Use o Auto gradiente DENSI Flow-ex para bombear o gradiente de baixo para cima do tubo contendo 1 ml da solução de sacarose 85% na parte inferior. Delicadamente, coloque o gradiente de temperatura de 4 ° C até refrigerado (2-4 horas). </li><li> Usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml suavemente o gradiente overlay com 0,25 ml da solução de sacarose 15% em STE contendo 1% Triton X-100. </li&gt; <li> Suavemente sobreposição com 0,25 ml da solução de sacarose 7,5% em STE usando um wide-bore uma ponta da pipeta ml. Tenha cuidado para não misturar as camadas. </li><li> Suavemente sobreposição com 0,5 ml de suspensão de vírus a partir do passo 2.4. Esta etapa deve ser realizada com cuidado para evitar qualquer perturbação no gradiente e mistura das camadas de sacarose underlaid. </li><li> Coloque os tubos no balde SW32.1Ti pré-resfriado e centrifugar a 32.000 rpm (187.000 xg em r max) durante a noite (16-20 horas) a 4 ° C. Para evitar a pausa da centrífuga, não comece a centrifugação até o vácuo na centrífuga chega a 250 mM </li><li> Colete 1 ml frações de cima para baixo do gradiente usando o gradiente de fraccionamento da Auto-DENSI-Flow. Coloque os tubos em gelo imediatamente após a coleta. Misturar o conteúdo dos tubos por inversão várias vezes, e retirar 50 ul de cada fração para a quantificação por ELISA ou ensaio de atividade da transcriptase reversa. </li></ol> 4. Localização de núcleos de HIV-1e armazenamento de núcleos <ol><li> Antes de realizar ensaios desencapsulamento, é importante para determinar quais frações contêm intacta HIV-1 núcleos. Isto pode ser determinado por ELISA p24 ou ensaio de atividade da transcriptase reversa usando os 50 mL alíquotas a partir do passo 3.6. </li><li> A recuperação da CA associado com os núcleos é muitas vezes relacionada com a estabilidade dos núcleos. Medir o núcleo associado CA por ELISA p24 9, utilizando uma amostra de cada fração. Alternativamente, medir a atividade da transcriptase reversa de cada fração. Usando ambos os métodos o pico deve ser em torno fração 10. </li><li> Piscina as frações contendo núcleos. Se os núcleos não devem ser usadas para desencapsulamento ensaio imediatamente, alíquota dos núcleos reunidos em 0,2-0,3 ml alíquotas, flash freeze-em N2 líquido e armazenar a -80 ° C. Núcleos congelados desta forma são adequados para o ensaio desencapsulamento. O rendimento do CA-core é tipicamente associada 1-2 mcg por mililitro de p24 ou cerca de 15% do total virion-associadop24. </li></ol> 5. Ensaio de cinética de HIV-1 desencapsulamento <ol><li> A quantidade de HIV-1 núcleos necessária por reação desencapsulamento é de aproximadamente 50 ng. Para executar o ensaio in vitro desencapsulamento, Pré-diluir a alíquota de núcleos com um volume igual de tampão 1XSTE frio para reduzir a viscosidade da suspensão e para minimizar os erros de pipetagem. </li><li> Diluir ainda mais 100 ul dos núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio contendo 10 mg / ml de BSA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Nós complementar o tampão STE com BSA (10 mg / ml) para minimizar a adsorção do CA para as paredes do tubo. Misture por vezes invertendo o tubo várias. Não vortex as amostras. Incubar os tubos em banho-maria a 37 ° C por intervalos de tempo (15, 30, 60 e 120 min). Os tubos devem ser imersas em banho de água pelo menos até o nível da amostra interna a fim de garantir até mesmo o aquecimento. </li><li> Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo do tubo periodicamente (normalmente 5 -10 min) por um movimento súbito do tubo. Para um controle minuto zero, diluir 100 ml de núcleos em 0,15 ml de tampão 1XSTE frio e incubar no gelo por todo o comprimento do experimento (120 min). O controle minuto zero dá o valor desencapsulamento basal e é usado para determinar aumento de desencapsulamento de núcleos incubados a 37 ° C por diferentes intervalos de tempo. </li><li> No final do período de incubação, parar o processo de desencapsulamento colocando os tubos em gelo durante 10 minutos. </li><li> Centrifugar os tubos a 45.000 rpm (TLA-55 rotor; 125.000 xg em r max) por 20 minutos a 4 ° C. Isto pellet núcleos intactos e os CA livre liberado como resultado de desencapsulamento de núcleos permanecerão no sobrenadante. O rotor deve ser pré-resfriada a 4 ° C antes de carregar as amostras. </li><li> Transfira o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga pré-resfriada de preferência usando gel-carregamento dicas armazenados em temperatura ambiente. Por favor, note que o pellet não será visível a olho nu, por isso tome cuidado extremo wnquanto pipetagem fora o sobrenadante. Volte a suspender as pellets em 250 mL de ELISA diluente de amostra (0,5% Triton X-100 e 5% dos doadores soro bovino em PBS). Para garantir a dissolução eficiente do pellet, vortex após adicionar o diluente de amostra ELISA. Quantificar o conteúdo de CA do pellet e sobrenadante usando ELISA p24 como descrito na seção seguinte. </li><li> A extensão da desencapsulamento é obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante. </li></ol> 6. Ensaio para a CA por ELISA p24 <ol><li> Muitos kits comerciais ELISA estão disponíveis e podem ser usados ​​para quantificar CA. Usar qualquer comercial ou &quot;in-house&quot; ELISA e incluem padrões p24 para determinar a linearidade do ensaio. Diluições das amostras devem ser testados para garantir a precisão. </li><li> Temos desenvolvido um ELISA caseiros que usam rotineiramente para ensaio para CA. O procedimento é adaptado de um relatório anterior 11 e é realizada utilizando detector de captura e anticorpos disponível a partir de AID NIHS Programa de Pesquisa e de reagente de referência. </li></ol> 7. Resultados representativos: Um exemplo de um resultado de ELISA para determinar frações contendo núcleo é mostrado na Figura 1. Após a coleta de frações (1 ml cada), 50 mL de amostra de cada fração foi usada para fazer diluições seriadas e analisados ​​por ELISA. O p24 total obtido somando os valores de doze frações foi de 14,5 mg. Como mostrado nas frações figura 8 a 10 núcleos contidos. O valor para as frações p24-core contendo 2,17 mg foi. A porcentagem de núcleos associados p24 (14,97%) foi determinado tendo a relação de valor para as frações p24 core (2,17 mg) para o valor total p24 (14,5 mg). Fração 1 ou 2 conterá sempre maior quantidade de p24, o que representa CA livre que não está associado com os núcleos. Isto é seguido por uma redução gradual nos valores de p24 com cada fração subseqüente, em seguida, um aumento acentuado e, finalmente, uma gota afiada no p24valores. Se é bom tomar cuidado ao carregar o gradiente, em seguida, o pico de core-associados da CA é encontrado em torno fração 10. Um resultado típico obtido através do ensaio de cinética de desencapsulamento de HIV-1 núcleos é mostrado na Figura 2. O gráfico mostra um aumento tempo-dependente em desencapsulamento de tipo selvagem HIV-1 núcleos. O percentual desencapsulamento valor foi obtido através do cálculo da fração de CA presentes no sobrenadante. Com a prática, o ensaio é altamente reprodutível e é útil para determinar a estabilidade dos núcleos viral in vitro. Por favor, note que a reprodutibilidade do ensaio é altamente dependente do tratamento adequado das amostras durante o procedimento. Uma vez que os núcleos são instáveis ​​o calor, as amostras devem ser mantidas a 4 ° C durante todo o ensaio, exceto durante o período de incubação. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> Figura 1 Equilibrium centrifugação em gradiente de densidade deHIV-1 núcleos. A suspensão de vírus concentrado foi aplicado para o topo de um gradiente de sacarose 30 a 70% linear coberta com 1% Triton-X-100. Após centrifugação durante a noite a 187.000 xg e 4 ° C, 1 ml foram coletadas frações de cima (Fração 1) para baixo (Fração 12) e p24 foi quantificada por ELISA. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> Figura 2 curso Hora do HIV-1 desencapsulamento in vitro. Purificada HIV-1 núcleos foram diluídos e incubados a 37 ° C para os intervalos de tempo indicado. A amostra min zero foi incubado em gelo por todo o comprimento do experimento. Após a incubação, as amostras foram ultracentrifugadas em 125.000 xg por 20 minutos a 4 ° C. Sobrenadante e pelotas foram separados e analisados ​​por ELISA p24. A extensão da desencapsulamento foi determinada conforme descrito no texto do protocolo. Cada reação desencapsulamento foi realizada em duplicata; barras de erro abrange a gama dos dois valores.

<ol>
	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. 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N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li><li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kr&#228;usslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. 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Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui para purificar HIV-1 núcleos para estudar desencapsulamento in vitro é útil para estudar esta fase do ciclo de vida do HIV-1, especialmente devido à indisponibilidade de um método validado para analisar HIV-1 desencapsulamento em células-alvo. Embora este método usa ultracentrifugação equilíbrio para purificar núcleos, outros autores utilizaram a peletização direta após lise breve com 1% Triton X-100-12, 13 ou peletização através de uma almofada de sacarose sobrepostas...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Nome do reagente </td><td width="197"> Companhia </td><td width="114"> Número de catálogo </td><td width="161"> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Composição: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl e 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajustar o pH a 6,95em temperatura ambiente. Filtro de esterilizar e armazenar em alíquotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpo de revestimento: anticorpo monoclonal para p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS Research and Reference Programa Reagente </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo primário: HIV-Ig (soro hiperimune paciente humano) </td><td> NIH AIDS Research e Programa de reagente de referência </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo secundário: Cabra anti-IgG humana, conjugado com peroxidase </td><td> Perfurar </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> Substrato HRP </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 placas bem </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti e rotores SW32.1 Ti e ultracentrífuga compatível </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 rotor e ultracentrífuga tabletop </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga de alta velocidade </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto DENSI-Flow de fraccionamento da gradiente de densidade </td><td> Labconco Corp </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> O ex-gradiente </td><td> CBS Scientific Co. Inc. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

O genoma do retrovírus é envolto em um capsídeo cercada por um envelope lipídico. Para lentivírus, como o HIV-1, o shell do capsídeo cônica é composto de proteína CA organizados como uma rede de hexágono. O capsídeo é fechada por sete pentamers no final largo e 5 na parte mais estreita do cone 1, 2. Encerradas nesta shell capsídeo é o complexo ribonucleoproteína viral, e juntos eles compõem o núcleo. Após a fusão da membrana viral com a membrana da célula-alvo, o HIV-1 é liberada no citoplasma. O capsídeo, em seguida, liberando desmonta CA livre na forma solúvel 3 em um processo conhecido como desencapsulamento. A localização intracelular eo calendário de HIV-1 desencapsulamento são mal compreendidos. Único amino-ácido substituições em CA que alteram a estabilidade do capsídeo também prejudicar a capacidade do HIV-1 para infectar as células 4. Isso indica que a estabilidade do capsídeo é crítico para infecção VIH-1. </p&gt; HIV-1 desencapsulamento tem sido difícil de estudar por falta de disponibilidade de ensaios sensíveis e confiáveis ​​para este processo. Aqui nós descrevemos um método quantitativo para o estudo in vitro utilizando desencapsulamento núcleos isolados de HIV-1 infecciosas partículas. A abordagem envolve o isolamento de núcleos por sedimentação de partículas virais concentradas através de uma camada de detergente e em um gradiente de sacarose linear, no frio. Para quantificar desencapsulamento, os núcleos isolados são incubados a 37 ° C para vários intervalos de tempo e posteriormente peletizadas por ultracentrifugação. A extensão da desencapsulamento é analisada pela quantificação da fração do CA no sobrenadante. Esta abordagem tem sido empregada para analisar os efeitos das mutações virais do HIV-1 estabilidade capsídeo 4, 5, 6. Deve também ser útil para estudar o papel dos fatores celulares em HIV-1 desencapsulamento.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Desencapsulamento é um passo essencial na fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e é definido como a desmontagem do shell capsídeo ea liberação do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP). Aqui, nós demonstrar técnicas para isolar núcleos intactos de HIV-1 virions e para quantificar a sua desencapsulamento<em&gt; In vitro</em&gt;.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K visualizações.  Vanderbilt University School of Medicine. Desencapsulamento é um passo essencial na fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e é definido como a desmontagem do shell capsídeo ea liberação do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP). Aqui, nós demonstrar técnicas para isolar núcleos intactos de HIV-1 virions e para quantificar a sua desencapsulamento In vitro.

Vídeo: In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a<em&gt; In vitro</em&gt; Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...