Agradecemos E. Massicotte e J. Senhor para assistência técnica especializada durante citometria de fluxo e experimentos com células de classificação. Além disso, gostaríamos de agradecer à equipe da clínica IRCM e todos os doadores para fornecer amostras de sangue. Amostras de sangue periférico foram obtidas de doadores adultos saudáveis, que assinaram termo de consentimento informado, em conformidade com a Declaração de Helsínquia ao abrigo de protocolos de pesquisa aprovados pelo Conselho de Revisão do Institut de Recherches Clínicas de Montréal (IRCM) ética em pesquisa. Os seguintes reagentes foram obtidos por meio do Programa Reagente NIH AIDS, Divisão de AIDS, NIAID, NIH: células MT4 do Dr. Douglas Richman; e rIL-2 humana do Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. Dr. Cohen é o destinatário da Canada Research Chair em Retrovirology Humano. Este trabalho foi financiado por doações de CIHR (CIHR 111226) com o Dr. Cohen e do Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) rede de aids para Dr. Bego e Dr. Cohen.

Notas gerais É importante manter as células em cultura sem nenhum antibiótico, uma vez que as infecções bacterianas podem ser ainda controlados detectada por PBMC. Tal detecção de componentes bacterianos irá induzir um interferão fundo de produção que não podem ser distinguidas das que desencadeada por específica de HIV-1 de detecção. Além disso, todas as células têm de ser rotineiramente testadas quanto à ausência de contaminação por micoplasma. Sempre use soluções livres de endotoxinas sempre que possível. Por citometria de fluxo caracterização das diferentes células para ser utilizado no processo de co-culturas (PBMC, pDCs, MT4 e células T CD4 +) é um passo opcional, mas altamente recomendada uma vez que pode fornecer informação valiosa necessária para uma interpretação correcta de uma dada experiência. 1. Preparação de células alvo infectadas <ol><li> Manter a linha de células CD4 + T humana MT4 em RPMI 1640 medium suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS), a partir de agora referido como RPMI-1640 completo. </li><li> Isolamento de células T CD4 + primárias. <ol><li> Isolar as células mononucleares a partir de sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade. </li><li> Isolar linfócitos T CD4 + usando um kit de selecção negativa de células T CD4 +, seguindo as recomendações do fabricante. </li><li> Activam linfócitos T CD4 + com PHA-G (5 ug / ml) durante 48 hr e, em seguida, se manter as células em meio RPMI-1640 completo suplementado com IL-2 recombinante (100 U / mL). Primária infectar células T 5 dias após o isolamento. </li></ol></li><li> A infecção de células alvo (linha celular MT4 T ou células T CD4 + primárias heterólogos). <ol><li> Dois dias antes do co-cultura, infectar as células T com vírus HIV-1. No exemplo específico descrito aqui foram usadas pNL4.3-GFP_ires_Nef tipo selvagem (WT) ou pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) vírus. Estas estirpes virais representam green proteína fluorescente (GFP) -marked clones moleculares infecciosos isogênicas que diferem apenas na sua capacidade de expressar Vpu. </li><li> Use diferentes multiplicidades de infecção (MOI) e selecione culturas com níveis semelhantes de infecção para co-culturas. O dia da co-cultura, determinar a percentagem de GFP + células por citometria de fluxo como marcador de infecção. Utilize apenas as culturas com uma gama de 20-50% de células infectadas para co-culturas. </li></ol></li></ol> Passos opcionais: Execute citometria de fluxo coloração neste momento para avaliar a expressão de moléculas de superfície / ligantes de interesse, como BST2, e CD4. Para a coloração da superfície celular, ressuspender 0,5 x 10 6 células T em 100 ul de solução de lavagem, adicionar 1 ml de anti-CD4_PerCP / Cy5.5 e 1 uL de anti-BST2_A660. Incubar os tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar com citometria de fluxo da solução de lavagem. Se os estudos visam avaliar o papel do antagonismo BST2 Vpu-mediada, executar uma HIV-1 partículaensaio de libertação neste momento como previamente descrito 15. 2. Isolamento e Enriquecimento de células (PBMC Sentindo inteiras ou pDCs enriquecido) Nota: Quando as PBMC são usadas para a detecção, isolamento começar dentro de meia hora após a coleta de sangue e conduzi-la em tempo hábil. Use PBMC imediatamente para colegas de culturas ou pDC enriquecimento. <ol><li> Isolar as células mononucleares a partir de sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade. Etapa opcional: Execute coloração multi-paramétrico de citometria de fluxo para confirmar que os PBMC isolados de fresco contêm as diferentes linhagens celulares em razões fisiológicas. Para a coloração da superfície celular, ressuspender 10 6 PBMC em 100 ul de solução de bloqueio de Fc, e incubar durante 15 min a 4 ° C. Após o bloqueio, adicionar 1 ul de anti-CD3_Pacific azul (para células T), 1 uL de anti-CD14-PE_Texas Red (para células mielóides), 4 ul de anti-BDCA2_APC e 1 uL de anti-ILT7_PE (por pDCs). Incubaros tubos durante 45 min a 4 ° C, antes da lavagem com citometria de fluxo da solução de lavagem. </li><li> Enriqueça pDCs usando um kit de seleção negativa pDC, seguindo as recomendações do fabricante. Recomenda-se rapidamente ao trabalho, manter as células frio, e usar soluções pré-arrefecida. Isto impedirá que o capeamento de anticorpos na superfície da célula e rotulagem de células não-específica, bem como assegurar a actividade máxima pDC. <ol><li> Realizar análise de citometria de fluxo multi-paramétrica dos pDCs recentemente isolados para confirmar a pureza, a percentagem de enriquecimento, e quantidades relativas de pdc- marcadores de superfície específica (como ILT7 e BDCA2). Para a coloração da superfície celular, ressuspender 10 4 pDCs em 100 ul de solução de bloqueio de Fc, e incubar durante 15 min a 4 ° C. Após o bloqueio, adicionar 1 ml de anti-CD3_Pacific Azul, 1 jul de anti-CD14_PE_Texas Vermelho, 4 jul de anti-BDCA2_APC e 1 ml de anti-ILT7_PE. Incubar os tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar com citometria de fluxo da solução de lavagem (PBS, 5mM de EDTA, 5% de FBS). Um mínimo de 40% de pureza PDC é recomendado (se o material de partida tem 0,4% pdc e isso seria equivalente a um enriquecimento de 100 vezes). </li></ol></li></ol> 3. Co-cultura de células infectadas T CD4 + e sensoriamento células (PBMC inteiras ou pDCs enriquecido) <ol><li> Misturar 220 mL de PBMC (diluído a 850.000 células / ml) ou 220 ul de pDCs (a uma concentração variando de 100.000 a 500.000 células / ml) com 30 ul de células T infectadas (diluído a 10 6 células / ml) por poço em um U-bottom placa de 96 poços. <ol><li> Como controlos, as CMSPs de placa ou pDCs e células T isoladamente. Ajustar o volume no poço para 250 ul com meio RPMI 1640 completo. </li><li> Avaliar respostas celulares ao agonista conhecido da via de TLR7 e TLR9. Para este fim, placa 220 uL de PBMC (diluído a 850.000 células / ml) ou 200 ul de pDCs (a uma concentração variando de 100.000 a 500.000 células / ml) por poço em uma de fundo em U de 96 poços e adicionar TLR7 agonista ( Imiquimod, concentração final: 2,5 ug / ml) ou TLR9 agonista (ODN CpG-A 2216, concentração final: 5 uM). Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 18-22 horas e processá-los de um modo semelhante às co-culturas descritas abaixo. </li></ol></li><li> Incubar co-culturas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 18-22 horas, e, em seguida, transferi-los para um fundo em V de 96 poços. Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. <ol><li> Transfira os sobrenadantes para uma de fundo plano de 96 poços. Os sobrenadantes podem ser armazenadas a -80 ° C ou usado para a detecção de IFN tipo I imediatamente. </li><li> Ressuspender as células co-cultivadas em 2% de paraformaldeído e analisadas utilizando citometria de fluxo. Devido a diferenças de tamanho e de granulação, células MT4 são facilmente distinguidos dos PBMC ou pDCs com base em seu lado de dispersão (SS) versus a frente-de dispersão (FS) perfis. Se as células T primárias são utilizadas como células alvo infectadas, estas podem ser marcadas com qualquer corante rastreador de células, tais como CSFE, antes da co-cultura. </li></ol></li><li> Medição de bioactivo do tipo I IFN, utilizando células HEK repórter de p-Azul IFN-a /. Nota: Estas células foram geradas por transfecção estável de células HEK293 com os genes STAT2 e IRF9 humanos para se obter um tipo totalmente activo I IFN via de sinalização. Eles também contêm o gene repórter de fosfatase alcalina segregada (SEAP), sob o controlo do IFN-α / p promotor indutível ISG54. A estimulação destas células com IFN tipo I activa a via JAK / STAT / ISGF3 via e induz a produção de SEAP. <ol><li> Manter as células HEK-Azul de IFN-α / p em DMEM suplementado com FBS a 10%. Placa-los a uma densidade de 50.000 células por cavidade em uma de fundo plano de 96 poços, num volume final de 180 ul. </li><li> Adicionar 20 ul de co-cultura sobrenadante de cada poço em duplicado. Cada chapa também requer um conjunto de controlos do padrão interno (IFNa humano, concentração final de 100 U / ml a 2500 U / mL). Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 18Hr -22. </li><li> Determinar os níveis de actividade da fosfatase alcalina utilizando uma solução de quanti-azul, o qual muda de cor de rosa a violeta / azul na presença da enzima. Prepare QUANTI Azul seguir as recomendações do fabricante. Adicionar 180 ul desta solução para cada poço de um de fundo plano de 96 poços. Para cada poço também adicionar 20 ul das células sobrenadantes de células HEK-Azul de IFN-α / p induzidas, e incuba-se a placa numa incubadora a 37 ° C até que a cor se desenvolve nos poços de padrão IFN de controlo. </li><li> Avaliar os níveis de SEAP, utilizando um espectrofotómetro a 620-655 nm, e determinar a concentração de IFN tipo I, por extrapolação a partir da parte linear da curva padrão de IFN. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Os protocolos aqui descritos medem a detecção de células T infectadas com vírus HIV-1 GFP que diferem apenas na sua capacidade de expressar a Vpu, como descrito no nosso relatório recente 18. No entanto, estes métodos podem ser facilmente modificados para estudar a detecção de vírus não marcados, assim como outros vírus que faltam os genes virais que podem potencialmente modular a detecção inata. Se os vírus utilizados não expressam GFP, a percentagem de células alvo infectadas deve ser determinada por um outro meio antes da co-cultura, tais como p24 (capsídeo) coloração intracelular e citometria de fluxo ou por ELISA p24. Além disso, estes protocolos podem ser utilizados com células T alvo diferentes, incluindo uma variedade de linhas celulares e células primárias disponíveis. Os métodos descritos neste manuscrito tem um número de vantagens quando comparada com as metodologias iniciais utilizados para estudar o HIV-1 de detecção. Em primeiro lugar e acima de tudo tem sido estabelecida por um número de grupos que isento de células HIV-1 partigos são indutores pobres do tipo I IFN 2,13,14. Além disso, os primeiros estudos invocado métodos baseados em ELISA IFNa mais velhos para quantificar a quantidade de IFN tipo I produzido. Uma limitação desta técnica de detecção é que a maioria dos kits mais velhos IFNct ELISA só medem um tipo de IFN, enquanto com vista para os outros tipos de IFNa e de IFNp. O uso das linhagens de células repórteres descritas ultrapassa esta limitação quanto à concentração de todas as formas bioactivos dos IFN tipo I humanos podem ser medidos ao mesmo tempo. A técnica é altamente sensível, menos caro do que a nova geração de kit de ELISA de IFN e por muitos dadores de grandes quantidades de IFN tipo I podem ser facilmente detectados. No entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilização com outros IFN de tipo-I leitura de métodos, tais como ELISAs. As etapas críticas: É importante que a qualidade de todos os componentes celulares (ambos os alvos e efetores) ser rigorosamente controladas. Contaminação potencial, mesmo quando asympsintomática, precisa ser monitorado e controlado. Como mencionamos anteriormente, antibiótico-controlada contaminação bacteriana assintomática, e potencialmente outros agentes patogénicos intracelulares, tais como o micoplasma, podem gerar respostas imunes semelhantes aos observados após a infecção pelo HIV-1, nomeadamente a produção de IFN tipo I. Além disso, todos os reagentes precisa de estar livre de LPS ou outras endotoxinas potenciais. De igual modo, a monitorização de PBMCs e pDCs também é importante uma vez que as amostras humanas pode muitas vezes ser preparadas por infecções contínuas subjacentes, que podem afectar de detecção normal. Nós recomendamos sempre a inclusão dos controlos negativos propostas, nomeadamente a ausência de células-alvo, bem como co-culturas com células falsamente infectadas. A viabilidade de células infectadas também é importante para a detecção pDC adequada desde o IFN tipo I não é produzida após a co-cultura com células apoptóticas 2,14. Uma limitação importante da técnica é a necessidade de células primárias isoladas de fresco. Este procedimento não foitestado utilizando PBMC ou pDCs que ou foram previamente congelados ou mantidos em cultura. O isolamento de PBMC é de trabalho intensivo e estas células têm uma vida útil muito limitada. Além disso, protocolos padrão para a proteção contra patogénicos de origem sangue deve ser usado durante o trabalho com sangue humano. Muitas vezes há várias fontes de variabilidade associados com o trabalho envolvendo células humanas isoladas de fresco. Entre eles estão os diferentes procedimentos utilizados para isolar essas células, e a variabilidade herdada encontradas a partir de dador para dador-. Embora seja impossível evitar a variabilidade entre doador, o uso dos controlos positivos sugeridas, tais como a medição de resposta a agonistas conhecidos de TLR7 e TLR9 vias, iria proporcionar um controlo interno importante para estas experiências. Observou-se que uma resposta robusta aos agonistas da via TLR9 poderia ser correlacionada com uma resposta pDC saudável, enquanto que uma via TLR7 responsivo é necessário para uma resposta adequada contra o HIV-1 3. 2, o enriquecimento de pDCs de PBMC muitas vezes não é necessário. No entanto, se o desenho experimental requer que (por exemplo, no contexto em que é necessária a depleção de marcadores específicos da superfície PDC) de selecção negativa é preferível a selecção positiva, as células permanecem livres de anticorpo, após o processo de selecção. Isolado pDCs sofrer rápida apoptose em cultura. Para as experiências que requerem estas células a ser cultivadas por um período prolongado de tempo, os meios de cultura pode ser suplementado com IL-3. Esta citocina induz a proliferação PDC e inibe a sua apoptose 16. No entanto, a IL-3 de utilização deve ser rigorosamente controlada, uma vez que pode levar à maturação PDC ou diferenciação. O método aqui descrito combina alvo de HIV-1 de células infectadas com PBMCs isoladas de fresco ou pDCs para recriar as etapas iniciais envolvidas durante a detecção inata. Este método será sem dúvida útil para explore primeiros eventos imunes inatas associados com a infecção pelo HIV. Embora os protocolos associados destinam-se a medição do tipo I IFN, eles poderiam facilmente ser modificada para medir outras moléculas bioativas liberadas a partir pDCs no reconhecimento das células infectadas. Estes poderiam incluir: IFN tipo III (IFN-λ), citocinas pró-inflamatórias (tais como o TNF-α e IL-6) e a CXCL10 quimiocinas, CCL4, CCL5 e 17.

Tipo I IFN-produzindo pDCs representam a primeira linha de defesa contra infecções virais, e, como tal, servir como um elo vital entre a imunidade inata e adaptativa 1. Enquanto as partículas de HIV-1 livre de células são fracamente detectada pelo sistema imune inato, células T CD4 + pelo HIV-1 infectadas são eficazmente detectada por pDCs 2. O mecanismo de detecção requer um contacto inicial entre a glicoproteína do envelope viral (gp 120) na superfície da célula T infectada e moléculas CD4 no PDC, que é então seguido pela captura do vírus e a internalização pela PDC. Reconhecimento subsequente do transferida HIV-1 RNA por TLR7 desencadeia a activação do Myd88 / via IRF7 e leva a um tipo I a produção de IFN 3. Importante, a segunda via de detecção presentes em pDCs, que é mediada por TLR9, é inibida pela interacção da glicoproteína virai, a gp120, com o marcador de superfície específico pDC-BDCA2 4. <p class="jove_content"&gt; As TLR7 e TLR9 detecção vias de pDC pode, potencialmente, ser modulada negativamente pela contratação de BST2 (também designado Tetherin ou CD317) com outro receptor inibitório superfície pDC específico chamado ILT7 5. BST2 é expresso em níveis elevados na superfície das PDC e algumas células cancerosas, mas a níveis relativamente baixos em outros tipos de células, tais como células B, macrófagos e células T. Importante, BST2 pode ser induzida por IFN tipo I em um número de linhas de células transformadas, bem como em culturas de células primárias de origens humanas e murinas 6. Para além da sua função imunitária reguladora, BST2 foi recentemente encontrada para inibir a libertação de VIH-1 e outra envolto partículas virais por partículas virais nascentes de ligação cruzada sobre a superfície da célula infectada 7. No caso do HIV-1, a proteína codificada por vírus acessório L (Vpu) foi mostrado que actua como um antagonista BST2. Acredita-se que regula negativamente Vpu BST2 a partir da superfície celular de células com HIV-1 infectadas, o local da sua cordaing atividade e como resultado aumenta a liberação viral e se espalhar 7, embora esta noção tem sido contestada 8,9. Na ausência de Vpu, um grande número de completamente formado e da progenia de HIV-1 maduro partículas são retidas na superfície da célula. Se estas partículas cativos poderiam representar alvos eficazes para detecção imunológico ainda permanece uma questão em aberto. Além disso, não está claro se Vpu poderia desregular a produção de IFN-I tipo de pDCs modulando superfície BST2 níveis. Os primeiros estudos concebidos para avaliar o HIV-1 de detecção foram realizadas utilizando partículas de HIV-1 livre de células, que são geralmente considerados pobres indutores de IFN tipo I 3,10-12. Dado que os estudos recentes sugerem que PBMCs e pDCs detectar eficientemente linfócitos infectados pelo HIV-T CD4 + 2,13,14, descreve-se aqui um método simples para medir as respostas inatas pDCs desencadeadas por cima do reconhecimento de células com HIV-1 infectadas in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

HIV-1 inato de detecção requer o contacto directo das células T CD4 + infectadas com células dendríticas plasmocitoides (PDCs). Para estudar este processo, os protocolos aqui descritos utilização de células isoladas de fresco mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou células dendríticas plasmocitoides (PDCs) para detectar infecções em nenhuma das linhas de células T (MT4) ou células T CD4 + primárias heterólogos. A fim de garantir uma detecção adequada, é essencial que as PBMC são isoladas imediatamente após a recolha de sangue e esta percentagem óptima de células T infectadas são utilizados. Além disso, a coloração de multi-paramétrico de citometria de fluxo pode ser utilizado para confirmar que contêm as amostras de PBMC diferentes linhagens celulares em proporções fisiológicas. Um certo número de controlos, também pode ser incluída para avaliar a viabilidade e a funcionalidade das PDC. Estes incluem, a presença de marcadores de superfície específicos, para avaliar as respostas celulares agonista conhecido de Toll-like receptors (TLR) vias, e confirmando a falta de sponsimultânea tipo I interferon (IFN) de produção. Neste sistema, PBMCs isoladas de fresco ou pDCs são co-cultivadas com o HIV-1 em células infectadas placas de 96 cavidades durante 18-22 hr. Os sobrenadantes destas co-culturas são então utilizadas para determinar os níveis de IFN de tipo I bioactivos através da monitorização da activação da via em células ISGF3 / p IFN-a HEK-Blue. Antes e durante condições de co-cultura, as células alvo podem ser submetidos a análise citométrica de fluxo para determinar um número de parâmetros, incluindo a percentagem de células infectadas, os níveis de marcadores de superfície específicos, e diferencial a morte de células infectadas. Embora, estes protocolos foram desenvolvidos inicialmente para acompanhar a produção do tipo I IFN, eles poderiam potencialmente ser usado para estudar outras moléculas imuno-moduladores liberados de pDCs e obter mais conhecimentos sobre os mecanismos moleculares que regulam HIV-1 sensoriamento inata.

O sistema de co-cultura descrito na Figura 1 permite para um estudo controlado de VIH-1 de detecção inata. Devido à natureza variável das células primárias, é importante que a proporção normal de células T e mielóide (CD14 + respectivamente e CD3 +) são observados, tal como no exemplo mostrado na Figura 2A. Além disso, apenas um reduzido número de células T activadas (FS mais elevados e níveis mais elevados CD3, em comparação com células não-T activadas) são desejáveis ​​nas culturas PBMC isolados de fresco. PBMC com relações anormais entre os vários tipos de células são muitas vezes incapazes de montar uma resposta imune inata adequada in vitro, provavelmente devido a um fenótipo já activada em consequência de uma infecção em curso. Mais importante ainda, a percentagem relativa de pDCs precisa de ser avaliada como se mostra na Figura 2B. Embora esta percentagem pode variar entre 0,2 e 1,2%, de um fenótipo de detecção anormal também é observada tanto com extremes desta gama. Enriquecimento de pDCs utilizando selecção negativa muitas vezes produz 50-95% pDC pureza, como pode ser visto nos dois exemplos a partir da Figura 2B (92% e 72%). Um exemplo prototípico para a experiência geral é mostrado nas Figuras 3 e 4. Neste exemplo, as células MT4 foram infectadas com pNL4.3 GFP_ires_Nef-WT ou delta Vpu para alcançar infecção de 30% no momento da co-cultura (Figura 3A). Como descrito anteriormente, apenas as infecções com vírus WT resultou numa regulação negativa significativa de BST2 superfície (Figura 3B). Devido às suas diferenças em tamanho e granularidade, as células MT4 podem ser facilmente distinguidos dos PBMC por citometria de fluxo (Figura 4A). Após a incubação de co-cultura, apenas as CMSPs em contacto com o conhecido agonista de TLR7 e TLR9 ou PBMC em contacto com HIV-1 libertadas quantidades significativas de células infectadas de tipo I IFN (Figura 4B). Não foi detectada IFN em PBMC por si só, em CMSPs de co-cultured com células MT4 não infectadas, ou em células MT4 infectadas por si só (Figura 4B). No exemplo aqui apresentado, a detecção inato de células MT4 com HIV-1 infectadas por PBMC foi encontrado para ser significativamente reduzida na presença de Vpu. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1:. Visão esquemática do desenho experimental SUP: sobrenadante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2: Caracterização fenotípica de PBMC isolados de fresco e enrpDCs iched. (a) distribuição normal de células mielóides e células T observados em PBMC isolado de um dador saudável (percentagem de células mielóides deve variar entre 10-20% e as células T entre 55-65%). Amostra PBMC foram coradas utilizando anticorpos conjugados com fluoróforos que reconhecem CD14 superfície (marcador de linhagem mielóide) e CD3 (marcador de células T). (B) Caracterização fenotípica de pDCs. Antes de pDCs enriquecimento representar entre 0,2-1,2% do número total de células dentro dos PBMC (0,99%, no exemplo mostrado). Estas células podem ser identificados com base na expressão de marcadores específicos, tais como BDCA2 e ILT7, presentes na superfície da célula. Selecção negativa pode ser utilizada para enriquecer significativamente o número de pDCs e eliminar contaminações potencialmente prejudiciais, tais como células mielóides CD14 + (enriquecimento, atingindo os 92% e 72% nos dois exemplos mostrados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>ck aqui para ver a imagem ampliada. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3:. Caracterização de células MT4-alvo de HIV-1-infectadas (A) Percentagem de células infectadas nas culturas MT4 infectadas com pNL4.3 GFP_ires_Nef-WT ou dVpu como determinada pela percentagem de células positivas para GFP. Expressão de superfície (B) da célula BST2 nas células infectadas foi avaliada após a coloração da superfície. As cinzas preenchido histogramas representam células falsamente infectadas coradas com o soro de coelho pré-imune (controlo unstained); os histogramas restantes representam células marcadas com anti-soro de coelho policlonal BST2. Histogramas com linhas contínuas representam controle negativo GFP (neg) células; enquanto histogramas com linhas pontilhadas correspondem a células (POS) infectados GFP positivos. Gripe dizerintensidade orescence valores (MFI) estão indicadas para cada amostra. A citometria de fluxo foi realizada e analisada como descrito na Figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4:. Co cultura de PBMC recentemente isolados e células T infectadas MT4 (A) Comparação de citometria de fluxo perfis FS / SS observados para células T MT4 sozinho, PBMC sozinho, ou co-culturas entre PBMCs e células MT4 T. Devido a diferenças no tamanho e granulosidade, células MT4 T ​​podem ser facilmente distinguidos dos PBMC em co-culturas, utilizando citometria de fluxo. (B) Exemplo representativo da quantidade de IFN tipo I libertada após estimulação de PBMC com TLR7 ou TLR9 agonista (atrás), ou após a co-culturas com zombaria ou as células MT4 indicados infectados com pNL4.3-GFP_ires_Nef WT ou dVpu. Os dados brutos mostrado como OD 650 valores e sua converseion correspondente ao tipo I IFN concentração expressa em U / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a>

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Ao contrário de partículas de HIV-1 livre de células, as células T CD4 + infectadas são eficazmente detectada pelas células dendríticas plasmocitoides (PDCs). Este manuscrito descreve um método em que as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou pDCs isoladas são co-cultivadas com o HIV-1 de células T infectadas para avaliar a detecção inata por pDCs como avaliada por libertação de IFN tipo I.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K visualizações.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  Ao contrário de partículas de HIV-1 livre de células, as células T CD4 + infectadas são eficazmente detectada pelas células dendríticas plasmocitoides (PDCs). Este manuscrito descreve um método em que as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou pDCs isoladas são co-cultivadas com o HIV-1 de células T infectadas para avaliar a detecção inata por pDCs como avaliada por libertação de IFN tipo I. 

Vídeo: Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Imunologia e Infecção

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

As células T Capturar Bactérias por Transinfection das dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

SILAC Based proteômica Caracterização de exossomas de HIV-1 células infectadas

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...