Este protocolo aborda algumas questões-chave existentes na geração organoide, como robustez e confiabilidade, e conseguimos aplicar esses organoides aprimorados a pesquisas inovadoras sobre envelhecimento neuronal. Heterogeneidade e reprodutibilidade são questões significativas na geração de organoides cerebrais corticais. Para superá-los, primeiro diferenciamos os HPSCs em colônias neuroectodérmicas e, em seguida, esferoides neuro epiteliais, que geram arquitetura de tecido reprodutível.
Esses organoides cerebrais cortical começam a apresentar sinais típicos de senescência após uma cultura in vitro prolongada, o que os torna uma plataforma útil para estudar processos neuronais relacionados ao envelhecimento. Para começar, emplaque as colônias hPSC em uma matriz de membrana de porão qualificada hESC a partir de um poço de seis placas de poço a 60% de confluência em três poços para atingir 20 a 30% de densidade e, em seguida, proceder com a indução de colônias neuroectodérmicas 2D. Adicione o meio N2 fresco complementado com inibidores SMAD duplos diariamente a cada poço pelos próximos três dias.
Para gerar esferoides neuroectodérmicos 3D de colônias neuroectodérmicas induzidas, remova dois mililitros de meio N2 da placa de seis poços e lave uma vez com HBSS para garantir que todo o meio N2 seja removido. Adicione um mililitro de desafeito a cada colônia que contenha bem. Incubar a placa por 20 a 25 minutos a 37 graus Celsius e verificar se há desprendimento da colônia regularmente.
No final da incubação, para parar a atividade da enzima despase, adicione um mililitro de meio N2 ao poço. Usando uma ponta de pipeta P1000 larga ou uma ponta de pipeta P1000 modificada cortada com uma tesoura estéril, transfira as colônias para um tubo de 15 mililitros e permita que os aglomerados da colônia afundem até o fundo do tubo com gravidade. Em seguida, com uma ponta de pipeta P1000 padrão, remova cuidadosamente o supernatante.
Substitua-o por um mililitro de médio N2 fresco e repita a lavagem três vezes para garantir a remoção completa da despase. Depois de reutilizar os aglomerados celulares e o meio N2, transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de seis poços e adicione 40 nanogramas por mililitro de bFGF. Depois de criogenar os organoides, remova a solução de montagem em excesso transferindo os slides para um recipiente de coloração de slides com uma tampa e lave o tecido organoide seccionado três vezes com PBS por 10 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, incubar os slides durante a noite a 37 graus Celsius com a solução de coloração beta-galactosidase recém-feita. Lave os tecidos manchados três vezes com PBS por 10 minutos cada um à temperatura ambiente para remover a solução beta-galactosidase. Agora monte os tecidos lavados com um montador de antifato de vidro e permita que a solução de montagem se solidifique por 30 minutos à temperatura ambiente antes de vê-lo sob o microscópio.
Antes da diferenciação neuroectodérmica, as colônias hPSC mostravam uma morfologia monocamada plana apertada sem células diferenciadas contaminando as colônias. A expressão de NANOG também confirmou a pluripotência das colônias hPSC. Após a diferenciação das colônias de hPSC em colônias neuroectodérmicas, observou-se uma morfologia de forma colunal mais longa, e elas deram negativo para NANOG.
Após o tratamento despase e exposição ao FGF2 no N2, as células-tronco neurais nesses esferoides proliferaram e formaram um número significativo de rosetas neurais que demonstraram a polaridade apical-basal do esferoide pela expressão de Z01 nas células no centro e na borda externa da esferoide. Uma vez incorporado, o esferoide prolifera rapidamente e começa a brotar, indicado pela presença dos nós de tecido compacto e sua expansão para fora do corpo principal entre uma a três semanas, o que foi confirmado pela análise quantitativa e o diâmetro esferoide aumentou significativamente ao longo de três semanas. A coloração da imunofluorescência confirmou a presença de células progenitoras neuro e marcadores de camada cortical nos organoides com camadas claras, observáveis em diferentes pontos de tempo.
O efeito dos processos relacionados ao envelhecimento neuronal no cérebro também foi estudado. Com o tempo, observou-se aumento significativo na presença de senescência associada à beta-galactosidase e, na semana 13, foi detectada a presença de p21, o que indica senescência. É importante garantir que todo o excesso de despase seja removido e que você desprende suavemente e ressarpe as colônias neuroectodérmicas intactas para formar esferoides saudáveis.
Esta plataforma de nossa oportunidade única de estudar a biologia de um envelhecimento cerebral humano, também permite uma pesquisa sobre o desenvolvimento cerebral crítico, desde que esses organoides sejam cultivados usando um bioreator.
