Financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC 011582. experimentos de imagem foram realizados na Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus Avançado Microscopia de Luz Núcleo apoiado em parte pelo NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Número UL1 RR025780 e os Transtornos Rocky Mountain Neurlogical Núcleo Centro Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac, do Instituto Salk nos forneceu os ratos GLYT2-GFP.

1. A genotipagem Optical 1. Optical Genotipagem do mouse filhotes de cachorro <ol><li> Entrada para a expressão do respectivo marcador fluorescente usando um ponteiro laser do comprimento de onda de excitação apropriado (405 nm, nas experiências descritas aqui) e correspondente óculos de filtro de bloqueio do comprimento de onda de excitação, mas passando o comprimento de onda de emissão (450 - 700 nm, nas experiências descritas aqui) . Apontar o ponteiro laser na parte posterior da cabeça ou espinal medula de rato a pup (ver Figura 1). Evitar que brilha o laser para os olhos e longa exposição da pele à luz laser. </li></ol> 2. Optical genotipagem de animais mais velhos <ol><li> Profundamente anestesiar o rato (p14 envelhecido ao p138 nas experiências descritas aqui) com uma overdose de pentobarbital através de uma injecção intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme anestesia adequada, verificando os reflexos do animal (apertar brevemente a ponta do the orelha ou uma das patas traseiras para o reflexo de retração da orelha ou na perna). </li><li> Nota: Apesar do uso de uma overdose de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos ao procedimento de injeção como &quot;anestesia profunda&quot; em vez de eutanásia, porque o animal é idealmente ainda vivo (ou seja, seu coração ainda está batendo), quando o cirurgia e começar a perfusão. Isto assegura uma perfusão mais eficiente dos órgãos internos incluindo o cérebro. </li><li> Uma vez que o animal não mostram quaisquer reflexos, remover cuidadosamente a pele que cobre o crânio (Figura 2A), fazendo uma incisão na pele que cobre a parte traseira da cabeça de corte e para o meio do crânio. Expor o crânio expostos a luz laser e observar a fluorescência através dos óculos de filtro, conforme descrito acima. Se um sinal de GFP positiva é observada, vá para a etapa 2, se não, sacrificar o animal através de decapitação (segunda / garantindo forma de eutanásia seguindo a nossaRegulamentos IACUC). </li></ol> Nota: Nos ratos mais velhos mesmo (&gt; 1 mês) a fluorescência podem ser observados através dos olhos do animal. 2. transcardial perfusão e Preparação Cérebro <ol><li> Perfundir transcardialmente com gelada salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4 1,76 mM, Na 2 HPO 4, 10 mM) utilizando uma agulha de seringa de 30 L para remover em grande parte do sangue a partir de o animal. <ol><li> Primeiro, abra cuidadosamente a caixa torácica com uma tesoura afiada e, em seguida, empurre a agulha para o ventrículo esquerdo do coração. Começar a bombear a PBS para o coração e a aorta e imediatamente após este passo abrir o átrio direito do coração com a tesoura para permitir que o sangue saia do corpo. Nota: Perfusão leva de 5 - 10 minutos, dependendo do tamanho do animal. </li></ol></li><li> Após sangria por meio de perfusão, decapitar o animal, garantir a sua cabeça com o pino needles (ou 30 g) por agulhas de seringa perfurar-los através dos soquetes de olho em um prato preparação e remover o cérebro do crânio. <ol><li> Em primeiro lugar, utilizar uma tesoura afiada para cortar a pele que cobre o crânio: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça, em seguida, cortada ao longo da linha média do lado dorsal da cabeça, cortada aos lados apenas caudal de os olhos do animal e por último corte na direcção caudal, para remover completamente os retalhos de pele na parte de trás da cabeça. </li><li> Em seguida, repetir o mesmo padrão de corte para o próprio crânio, certifique-se de remover ambas as cócleas no processo, porque isso irá simplificar significativamente a remoção do tronco cerebral no final. Após este procedimento, a metade caudal do cérebro deve situar-se completamente exposta. </li><li> No passo seguinte, utilizar uma lâmina de barbear afiada ou um bisturi para cortar através de todo o cérebro anterior com um ângulo de cerca de 45 ° e cerca de 2 mm rostral do cerebelo. Retire a metade da frente separados do cérebro com abespátula ent. </li><li> Usar uma espátula para elevar a metade caudal do cérebro na sua extremidade rostral e subsequentemente cortar os nervos cranianos que ainda estão ligados ao tronco cerebral no seu lado ventral. Como resultado final, a metade caudal do cérebro, incluindo o tronco cerebral devem cair livremente fora do resto da cabeça preparados para animais. </li><li> Vire a metade caudal removido do cérebro para expor seu lado ventral e corte ao longo do plano coronal apenas rostral (para as injeções anterógradas) ou apenas caudal (para as injeções retrógradas) das &quot;lâmpadas&quot; ventrally localizados contendo o corpo trapézio (veja o passo 2.3). <ol><li> Utilize sempre uma lâmina afiada ou um bisturi para o procedimento de corte para minimizar a morte celular causada por estresse mecânico excessivo sobre o tecido. Como resultado final, um explante cérebro que mede cerca de 1 cm de comprimento e contendo o complexo olivar superior completa ao longo de outras regiões do cérebro deve ter sido obtida. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Nota: Este protocolo demonstra o processo de injecção de um traçador no corpo trapezoidal localizado no tronco cerebral auditivo. Adaptar a localização e a orientação dos planos de corte e dos locais de injecção, conforme necessário. Se as regiões do cérebro fluorescentes de interesse estão muito próximas o suficiente para a superfície do cérebro, de modo que eles podem ser identificados e injectados sem cortar o cérebro (ver Figura 2B), então o passo de corte coronal pode ser omitido. <ol start="3"><li> Identificar o corpo trapézio como dois ventrais proeminentes &quot;lâmpadas&quot; contendo o núcleo ventral do corpo trapézio (VNTB). </li></ol> Nota: Para mais referência anatômica em relação à localização estereotáxica aproximada desses planos de corte, consulte Franklin &amp; Paxinos de 2008. Panel 78 dos atlas, Bregma ~ -5,7 mm mostra o núcleo medial do corpo trapezóide (= MNTB) rotulados como &quot;Tz &quot;. Painel 69 mostra o núcleo ventral do bo trapezoidaldy (VNTB) rotulados como &quot;MVPO&quot; (núcleo periolivary medioventral) 19. 3. anterógrada / retrógrada Tracing Nota: Execute todos os procedimentos a seguir em RT (25 ° C). <ol><li> Após o corte, colocar o explante do tronco cerebral em um prato de preparação contendo oxigenada (95% O 2, 2 5% de CO) dissecando solução (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glicose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1.25 mM, NaHCO3 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), prendendo-o com 30 g de agulhas de seringa. Assegure-se que a área de injecção está virada para cima. </li><li> Puxar pipetas de injecção de vidro de borosilicato e enchê-los com uma das três soluções seguintes: a) um / ml, solução 1,0 mg de subunidade choleratoxin-b conjugado com um fluoróforo Alexa 555 em PBS 12-13 (usado principalmente para transporte retrógrado), b ) um -d 1%ilution em 0,9% de solução salina de tetramethylrhodamine dextrano 555 (3.000 MW, usado principalmente para transporte retrógrado) ou c) um -dilution 1% em solução salina 0,9% de 10.000 MW dextrano-TRITC 555 (usado principalmente para o transporte anterógrado). <ol><li> Assegure-se que as resistências das pipetas de injecção gama 2,5-3,5 MOhm e que eles são fabricados em 3 - 4 ciclos de tracção. Para as experiências aqui descritas, conseguir isto seleccionando um algoritmo pré-programado puxando o puxador na pipeta. </li></ol></li><li> Iluminar o explante cérebro usando um ponteiro laser montado estaticamente do comprimento de onda apropriado (produto n ° 2 na Figura 3A; comprimento de onda de 405 nm, nas experiências descritas aqui). Use o ponteiro laser como um guia para as preparações injectáveis, e tem como objectivo o feixe de laser no núcleo cérebro marcado fluorescentemente ou células de interesse que será injectada. </li><li> Encontrar e observar a área alvo iluminado através de um microscópio binocular enquanto usava os óculos de filtragem compatíveis (450 - 700 nm, filtro passa-banda, nas experiências descritas aqui). Inserir o eléctrodo de injecção através do micromanipulador para a área de interesse. </li><li> Injectar a substância marcadora. As injecções de composto de 2 - 10 impulsos de pressão a 15 psi durante 50 ms cada, utilizando um dispositivo de injecção à pressão, dirigido perpendicularmente para a região de interesse (ROI) no interior da secção de cérebro. Administrar cada impulso de pressão em intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que o corante se espalhar. </li><li> No caso das injecções de tetrametilrodamina (TRITC), adicionalmente estimular electricamente para melhorar a absorção do corante através de electroporação com o eléctrodo colocado na área do cérebro de interesse (MNTB e VNTB nas experiências descritas aqui). <ol><li> Use 8 pulsos TTL de 8 Volts por 50 ms com 50 ms de intervalo entre intervalos, impulsionado por um estimulador e amplificados a 55 V com uma unidade de isolamento, a estimulação (itens No. 7 e 9 na Figura 3B). Use 10 - 20 repetições deste protocolo, administered durante vários minutos 7,8. Certifique-se para aterrar o eletrodo corretamente - o fio terra deve ser conectado à solução do banho! </li></ol></li><li> Entrada para o sucesso da injecção. Uma vez que um marcador fluorescente com um comprimento de onda de emissão também já está a emitir um sinal de fluorescência após excitação laser com comprimentos de onda mais curtos, para verificar visualmente a absorção do corante / espalhar na área alvo injectado enquanto iluminando a área com o laser e observando através dos filtros de óculos. </li></ol> 4. Incubação <ol><li> Após a injecção, incubar o tronco cerebral em oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucose 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, fez-se borbulhar 95% de O2 - 5% de CO2) à temperatura ambiente (TA, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, enquantoo corante está a ser transportado. Bolha da solução durante todo o período de incubação. </li><li> Subsequentemente, transferir os tronco cerebral em 4% de paraformaldeído (PFA) dissolvido em PBS (aproximadamente 100 mL;. PH 7 para a mistura de PFA / PBS) e incuba-se-lhes a 4 ° C para permitir a pós-fixação durante a noite (O / N). </li></ol> 5. Tissue corte e montagem <ol><li> No dia seguinte, o tronco cerebral lavar três vezes em PBS (5 min para cada passo de lavagem), cobri-lo em 4% de agar e, em seguida, cortada em 50 - 80 pm de espessura fatias em um vibratome. Fatias de montagem utilizando um meio de montagem sobre uma lâmina de vidro, e lamela. </li><li> Opcionalmente, rotular as secções com Nissl fluorescente durante 25 min (por exemplo, azul de Nissl em uma diluição de 1: 100 em meio AB). <ol><li> Para preparar meios AB, misturar 250 ml de tampão fosfato 0,2 M (PB; KH 51 mM 2 PO 4, 150 mM de Na 2 HPO 4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml de 10% de Triton-X, de 220 ​​ml ddH2O e 5 g de albumina de soro bovino. </li><li> Precede e sucede à rotulagem passo Nissl por 3 etapas de lavagem em PBS (10 min cada). </li></ol></li></ol> Nota: Nos casos em secções mais espessas necessitam de ser montadas e analisadas (em experiências aqui descritas tais fatias foram 100 - 500 mícrons de espessura para preservar ligações axonais ao longo de distâncias maiores), a técnica pode ser combinada com a limpeza dos tecidos. Nós encontramos o ClearT2 12 para ser bem sucedido 20. Quando um passo de compensação tecido está incluído, realizá-la antes da montagem das seções.

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A força geral de in vitro tracer eletroporação, ao contrário de estudos in vivo de rastreamento, é que ele dá aos pesquisadores um melhor acesso à área do cérebro de juros e, portanto, não envolve estereotáxica caro (e muitas vezes eletrofisiológico) equipamentos. Além disso, o período de sobrevivência requerido para os explantes cerebrais abrange apenas algumas horas (1 - 4) em vez de dias ou mesmo semanas, no caso de in vivo injecções marcador (ver uma revisão detalhada sob...

A fim de estabelecer um certo (micro) circuito neuronal, deve-se começar por encontrar os vários participantes do referido circuito, e seu padrão de conexão. Desde a publicação de Waller sobre rastreamento através de Lesão uma grande variedade de técnicas de rastreamento neuroanatomical neurofiber foi estabelecida. Algumas destas técnicas podem ser aplicadas no tecido fixa post mortem 2-4, outros contam com o transporte activo do corante em neurónios vivos, como descoberto em 1971 5-6. Os últimos podem ainda ser subdivididos em dois grupos que discriminam entre os métodos aproveitando retrógrada activo (a partir da zona injectada para a fonte de uma determinada projeção, ou seja. O somata de neurónios que se projectam para a referida área) e anterógrada activo (a partir do injectados área para o destino de uma determinada projeção, ie. as projeções axonal e os terminais axonais dos neurônios marcados) de transporte. Além disso, em alguns casos tramaterial de CER é injectada em animais vivos que, em seguida, sobrevivem a injecção por vários dias ou semanas (em injecções vivo tracer), enquanto que em outros casos cérebros explantados são injectados e incubar durante várias horas após a injecção no líquido cerebrospinal artificial (in vitro injecções tracer) . Neste protocolo, modificou um já existente na técnica de eletroporação vitro 7-8 para rotular somata e processos neuronais em anterógradas e rastreamento retrógrado experimentos usando choleratoxin subunidade-b e tetramethylrhodamine dextrano como as substâncias de rastreamento. O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar neurocientistas com uma ferramenta eficiente para traçar padrões de conectividade neuronal entre diferentes núcleos cerebrais, enquanto aproveita as vantagens das linhas de camundongo transgênico disponíveis e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão do alvo durante injeções traçadores. Embora o método de anterógrada e retrógrada usando o rastreamentocholeratoxin e amina de dextrano e os seus respectivos conjugados marcados com fluorescência não é nova 9-13 (como é o método de electroporação, por exemplo. Haas et ai. 14), a combinação de marcador com injecções electroporação numa preparação in vitro envolvendo blocos de tecido cerebral é um desenvolvimento mais recente 7. A sua principal vantagem sobre as técnicas de rastreio neuronais utilizando o mesmo tipo de corantes marcador nos animais vivos é o aumento da intensidade de marcação, em virtude da maior eficiência com que o corante é a electroporação podem ser tomados por neurónios. Uma vantagem adicional é o período de incubação encurtado (necessário para o transporte de corante) e da sua maior precisão o alvo durante a injecção do traçador, porque o experimentador tem o controlo visual sobre a área alvo da injecção. Este último também significa que nenhum equipamento caro estereotáxica é necessário para encontrar núcleo ou o cérebro área de interesse. Para addicionalmente aumentar a precisão da focalização, que se aproveitou de uma linha de camundongo transgênico, que expressa GFP na sua subpopulação glicinérgica de neurônios 15 e equipamentos ópticos de base constituídos por um ponteiro laser de mão de 405 nm óculos de filtragem comprimento de onda e correspondência passa-banda (450 - 700 nm). Assim, conseguimos uma aumento significativo no direccionamento precisão, identificando a área de injecção através do seu sinal de fluorescência e ao proporcionar uma forma mais fina para controlar a difusão do corante dentro da área de injecção através da observação da interacção entre o sinal de GFP nativa e o traçador fluorescência. A nossa técnica também permite descobrir a funcionalidade de um circuito, juntamente com a sua conectividade por identificar neurónios inibitórios GFP positivas (ou excitatório em outras linhas de rato) que foram preenchidos com o traçador. Em resumo, ainda mais reforçada uma poderosa ferramenta para estudar o neuroscientific conectoma do cérebro de vertebrados e avaliar tEle características diferentes neuroanatomical de um determinado neurocircuit. Ao usar camundongos transgênicos, juntamente com equipamentos ópticos barata e amplamente disponível, fomos capazes de aumentar significativamente a precisão da focalização dos nossos injeções. Além disso, os ratinhos transgénicos nos permitiu identificar o tipo das ligações rastreadas, que ajudaram a descobrir a funcionalidade de um microcircuito inibitório no tronco encefálico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

Nós apresentamos uma técnica que combina um protocolo in vitro injecção traçador, que utiliza uma série de impulsos eléctricos e de pressão para aumentar a absorção do corante através de electroporação em explantes de cérebro com iluminação laser direcionados e correspondentes óculos com filtro durante o procedimento. A técnica descrita de electroporação in vitro, por si só produz relativamente bom controlo visual para o objectivo de certas áreas do cérebro. Combinando-a com excitação laser de marcadores genéticos fluorescentes e sua leitura através de óculos de proteção do filtro de passagem de banda, o que pode pegar as emissões das células geneticamente marcadas / núcleos e o corante de rastreamento fluorescente, um pesquisador pode aumentar substancialmente a precisão das injeções encontrando a área de interesse e para controlar a propagação de corante / absorção na área de injecção muito mais eficientemente. Além disso, a técnica de iluminação do laser permite estudar a funcionalidade de um determinado neurocircuit por provIding informações sobre o tipo de neurónios que se projectam para uma determinada área em casos em que a expressão da GFP está relacionada com o tipo de transmissor expressa por uma sub-população de neurónios.

As Figuras 1 e 2 mostram como o ponteiro laser e óculos de laser podem ser usados ​​de forma rápida e barata genótipo animais positivos para GFP de uma ninhada. Em casos de jovens filhotes de rato, a técnica pode ser utilizada para identificar de forma não invasiva etiqueta GFP em cérebros do animal através do crânio e a pele sobrejacente (Figura 1A - D). A fluorescência emitida pode ser visto através da pele e o crânio de filhotes de rato, pelo menos até ao dia pós-nat...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K visualizações.  University of Colorado School of Medicine.  Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem. 

Vídeo: Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Neurociência

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

De circuito fechado experiências neuro-robótico para testar as propriedades computacionais da Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...