Este protocolo visa usar organoides cerebrais para estudar doenças mitocondriais. Foi desenvolvido para gerar organoides cerebrais reprodutíveis na avaliação de suas propriedades mitocondriais. Este método não requer bioreatores caros e procedimentos de incorporação demorados.
Portanto, é fácil de implementar e upscale. Este protocolo permite gerar organoides cerebrais reprodutíveis e testar suas propriedades mitocondriais. Isso pode levar à identificação de alvos intervencionistas para doenças mitocôndrias intratáveis.
Para começar, cultura iPSCs humanos em condições livres de alimentadores em meio iPSC em placas revestidas de seis poços e mantê-los em uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Passagem os iPSCs em 80% de confluência usando meio de desprendimento livre de enzimas em proporções que variam de um por quatro para um por 12. Para aumentar a sobrevida celular, adicione 10 proteínas associadas a micromolar quinase ou inibidor de ROCHA após cada divisão.
Dissociar os 80% de iPSCs no dia zero. Prepare o meio de diferenciação cortical ou CDM1 e pré-aqueça-o à temperatura ambiente antes de adicioná-lo às células. Lave os poços que contêm os iPSCs com PBS para remover células mortas e detritos.
Adicione 500 microliters de reagente pré-aquecido A a cada poço e incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Verifique sob o microscópio para garantir o desprendimento celular. Adicione um mililitro de meio iPSC para diluir o reagente A para neutralizar sua atividade.
Use uma pipeta de 1.000 microliter para dissociar as células encanando as células, encanando para cima e para baixo e transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar suavemente os iPSCs a 125 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente, em seguida, aspirar cuidadosamente o supernatante para evitar perturbar a pelota celular. Resuspende a pelota com um mililitro de MDL1 para obter uma única suspensão celular e contar o número do celular.
Prepare o meio de semeadura com 9.000 iPSCs por 100 microliters em CDM1 suplementado com 20 inibidores de ROCK micromolar, três inibidores de catenin WNT micromolar ou IWR-1, e cinco micromolar SB-431542. Adicione 100 microliters de meio de semeadura por poço a uma placa inferior V de 96 poços. Mantenha a placa em uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para gerar neuroesferas, no primeiro dia, observe que agregados de células redondas com bordas lisas definidas estão se formando. Note as células mortas ao redor dos agregados. Continue a cultura na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No terceiro dia, agitar a placa tocando nas laterais três vezes para desprender células mortas, em seguida, adicione 100 microliters de MDL1 complementado com 20 inibidores de ROCK micromolar, três micromolar IWR-1, e cinco micromolar SB-431542 para cada poço. Mantenha a placa na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No sexto dia, remova cuidadosamente 80 microliters do meio sobrenatante de cada poço.
Evite tocar na parte inferior do poço. Adicione 100 microliters de MDL1 complementados com três micromolar IWR-1 e cinco micromolar SB-431542 para cada poço e incubar a placa. Repita a etapa anterior após cada três dias até o dia 18.
No dia 18, para transferir neurosferas, preparar o MDL2 e adicionar 10 mililitros a uma placa de cultura celular de 100 milímetros ultra baixa. Use uma pipeta de 200 microliter com a ponta cortada para transferir as neurosferas redondas da placa de 96 poços para a placa de cultura celular de 100 milímetros ultra baixa. Remova cinco mililitros de meio da placa contendo as neurosferas e adicione cinco mililitros de CDM2 fresco.
Coloque a placa em um agitador orbital a 70 rotações por minuto dentro de uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A cada três dias, aspire cuidadosamente o meio supernante e substitua-o por cdm2 fresco. Deixe uma pequena quantidade do meio para evitar que as neurosferas sequem.
No dia 35, prepare o CDM3. Aspire o meio da placa e adicione 10 mililitros de CDM3 frio. Depois de mudar o meio, coloque a placa de volta em um agitador orbital a 70 rotações por minuto dentro de uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Mude o meio a cada três ou cinco dias, dependendo da taxa de crescimento indicada pela cor do meio. No dia 70, prepare o CDM4. Use o meio CDM4 até que a idade desejada dos organoides seja alcançada.
Durante este período, mantenha a placa em um agitador orbital a 70 rotações por minuto dentro de uma incubadora de cultura tecidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Mude o meio a cada três ou cinco dias, dependendo da taxa de crescimento. Prepare a solução 4%PFA e coloque-a sob um capô de segurança.
Colete organoides cerebrais e transfira-os suavemente com uma pipeta pasteur de três mililitros de plástico para uma placa de seis poços cheia de PFA. Mantenha os organoides na solução PFA por uma hora em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o PFA com uma pipeta Pasteur de plástico de três mililitros e lave os organoides fixos três vezes usando PBS.
Armazene os organoides fixos a quatro graus Celsius em PBS até uso posterior. Os organoides gerados usando este protocolo contêm neurônios maduros que podem ser visualizados usando marcadores proteicos específicos para axônios e dendritos. Organoides maduros contêm não apenas células neuronais, mas também células gliais.
Usando a análise de organoides cerebrais fatiados, é possível monitorar os axônios positivos SMI 312 e dendritos positivos MAP2 ou as células gliais beta S100. Além disso, imagens confocal ajudam a investigar a distribuição detalhada e organização de progenitores neurais positivos SOX2 em relação aos neurônios positivos da tubulina beta-3. Organoides cerebrais foram manchados para marcadores específicos de mitocôndrias, como translocase de membrana externa ou TOM20.
O perfil bioenergénico dos organoides cerebrais foi realizado medindo ambos os metabolismos mitocondriais usando a taxa de consumo de oxigênio, ou OCR, e o metabolismo glicóltico usando a taxa de acidificação extracelular, ou ECAR. A oligomicina causa uma queda no perfil OCR e, portanto, identifica o OCR necessário para a produção de ATP. Após o tratamento da oligomiecina, também pode haver um aumento compensatório no ECAR sugerindo que as células podem aumentar a glicólise para evitar o estresse metabólico.
Ao transferir as neurosferas da placa de 96 poços para uma placa de cultura ou durante o procedimento de fixação, é crucial manusear os organoides suavemente para evitar danificá-los. Seguindo a geração de organoides cerebrais, matriz multi-eletrodo ou imagem de cálcio seriam métodos ideais para testar a funcionalidade dos organoides.
