Entender como os astrócitos desenvolvem e estabelecem sua morfologia complexa é essencial para entender como o cérebro se desenvolve e funciona. Este protocolo descreve como analisar aspectos-chave da morfologia astrócito no tecido cerebral. Este protocolo usa um código personalizado para medir o volume de território de astrócito em seções de tecido grosso.
Essa estratégia também pode ser aplicada para medir a quantidade de sobreposição de território entre os astrócitos vizinhos. Combinando este protocolo com manipulação genética de astrócitos, pesquisadores podem investigar diretamente o papel de proteínas e caminhos específicos no desenvolvimento de astrócitos e interação astrócito para começar, preparar uma nova solução de TBST adicionando 1 mililitro de 10%Triton X a um tubo de 50 mililitros e preenchendo o tubo a 50 mililitros com TBS. Prepare 2 mililitros de soluções de bloqueio e anticorpos para cada cérebro, combinando soro de cabra e TBST em uma TBST. Tubo de 15 mililitros.
Em seguida, rotule uma placa de 24 poços para colocar diferentes amostras em diferentes linhas em diferentes soluções em diferentes colunas, em seguida, adicione um mililitro de TBST às três primeiras colunas rotuladas como lavagem 1, lave 2 e lave 3, e adicione 1 mililitro de solução de bloqueio à quarta coluna. Prepare uma picareta de vidro derretendo a extremidade de uma pipeta Pasteur de 5,75 polegadas em um pequeno gancho usando um queimador Bunsen, em seguida, transfira seções de tecido da placa de 12 poços para a lavagem 1 coluna da placa de 24 poços usando a picareta, em seguida, lave as seções por 10 minutos cada na lavagem 1, 2, e 3 poços usando a picareta de vidro para transferir as seções de um poço para o outro, seguido pela incubação das seções por uma hora na solução de bloqueio. Prepare q mililitro de solução de anticorpos primários adicionando o anticorpo à solução de anticorpos, em seguida, vórtice brevemente e centrífuga por 5 minutos maior ou igual a 4.000 vezes g a 4 graus Celsius.
Em seguida, incubar as seções em anticorpos primários por 2 a 3 noites a 4 graus Celsius enquanto treme. Após a incubação de anticorpos primários, aspire o dia-1 TBST dos poços de lavagem, em seguida, adicione 1 mililitro de novo TBST a cada lavagem bem e mova as seções para o primeiro poço de lavagem. Em seguida, incubar seções em anticorpos secundários por 3 horas em temperatura ambiente.
Após a incubação de anticorpos secundários, aspire o dia-2 TBST dos poços de lavagem, em seguida, adicione 1 mililitro de novo TBST a cada lavagem bem e mova as seções para o primeiro poço de lavagem. Durante a lavagem final, retire a mídia de montagem a partir de 4 graus Celsius e deixe-a aquecer até a temperatura ambiente, em seguida, prepare uma mistura de 2-para-1 de TBS e água desionizada e adicione-a a uma placa de Petri. Em seguida, prepare um slide de microscópio adicionando 800 microlitros de mistura de 2 para 1 de TBS e água desionizada à superfície.
Transfira as seções da lavagem 3 bem para a placa de Petri, em seguida, usando um pincel fino, transfira as seções uma de cada vez da placa de Petri para o líquido no slide. Em seguida, organize cuidadosamente as seções para que elas fiquem planas no slide usando o pincel. Cuidadosamente, remova o excesso de líquido do slide com uma pipeta P-1000, seguida de aspiração de vácuo.
Uma vez que todo o excesso de líquido seja removido do slide, use uma pipeta de transferência para adicionar imediatamente 1 gota de mídia de montagem a cada seção e coloque suavemente um deslizamento de cobertura sobre o slide. Permita que a mídia de montagem se espalhe por alguns minutos e, em seguida, remova qualquer excesso de mídia de montagem que sai sob o deslizamento de cobertura por aspiração de vácuo. Depois, sele todas as quatro bordas da tampa com esmalte claro.
Deixe os slides secarem por 30 minutos à temperatura ambiente e depois armazene-os a 4 graus Celsius. Usando um objetivo de 10x, localize células individuais para imagem e observe a região ou sub-região específica do cérebro relevante para o experimento, em seguida, usando o botão de foco, determinar se todo o astrócito está contido dentro da seção. Depois, mude para um objetivo de óleo de ampliação mais elevado e leve a célula ao foco.
Ao olhar através da peça do olho, use o botão de foco para mover-se da parte superior para a parte inferior da célula e, em seguida, inspecione visualmente a célula para garantir que toda a célula esteja contida dentro da seção. Usando o software de aquisição associado aos microscópios confocal, ajuste os parâmetros de aquisição para obter uma relação sinal-ruído adequada e nível de detalhe, em seguida, use zoom 2x para um objetivo de 40x e sem zoom se usar um objetivo de 60x ou 63x. Defina os limites superiores e inferiores da pilha Z com um tamanho de passo de 0,5 micrômetros garantindo que todo o astrócito esteja sendo capturado com a primeira e última imagens sem qualquer rotulagem fluorescente da célula.
Antes de iniciar a análise, instale o arquivo de extensão do casco convexo, XtspotsConvexHull, colando o arquivo na subpas pasta rtmatlab da pasta XT. Usando o Conversor de Arquivos Imaris, converta imagens em formato IMS. Em seguida, abra um arquivo de imagem no software de análise de imagens e selecione o botão 3D View para visualizar a imagem no modo 3D, garantindo que a célula atenda aos critérios de inclusão.
Para criar uma superfície, clique no ícone azul Adicionar novas superfícies e, em seguida, crie uma região de interesse ao redor da célula, inserindo dimensões nas caixas sob o tamanho da ferramenta de criação de superfície ou arrastando as bordas da caixa amarela. Em seguida, ajuste a Intensidade Absoluta limiar arrastando a barra amarela ou inserindo valores na caixa para que a superfície cinza preencha o máximo possível do sinal celular sem ultrapassar o limite da célula. Depois, clique no arqueiro verde para terminar de gerar a superfície.
Inspecione cuidadosamente a superfície recém-gerada e exclua quaisquer peças de superfície que não façam parte da célula selecionando-as e, em seguida, clique na ferramenta Editar lápis seguida da opção Excluir. Para unificar as peças de superfície restantes, clique no ícone Filtro de Funil para selecionar todas e clique no ícone Editar lápis e selecione a opção Unificar. Clique no ícone laranja Adicionar novas manchas e selecione o canal de origem correto da lista de drop-down e, em seguida, insira um valor estimado de diâmetro XY de 0.400 micrômetros na caixa.
Em seguida, clique no arqueiro verde para terminar de criar as manchas e, em seguida, reselecione os pontos. Clique no ícone Filtro e selecione Shortest Distance to Surfaces Surfaces X, onde as superfícies X são a superfície que está sendo analisada a partir da lista de queda, garantindo que tanto os botões de limite inferior quanto os botões de energia do limiar superior sejam verdes. Em seguida, insira uma distância mínima de menos 1,0 micrômetro na caixa de limiar inferior e uma distância máxima de 0,1 micrômetros na caixa de limiar superior e clique no botão Seção Duplicada para Novos Pontos, garantindo que as manchas recém-criadas seja selecionada no painel superior esquerdo da janela de software.
Depois, clique no ícone Gear Tools e clique no plugin Convex Hull apenas uma vez e espere que a janela MATLAB apareça e, em seguida, desapareça resultando em um casco sólido na exibição 3D. No painel superior esquerdo, certifique-se de que o Casco Convexo de Pontos X Seleção, a distância mais curta onde a seleção de pontos X é os pontos recém-criados é selecionado e, em seguida, clique no casco para selecioná-lo. Em seguida, clique no ícone Estatísticas de Gráficos.
Na guia Seleção, certifique-se de que valores específicos seja selecionado na lista de quedas superiores e, em seguida, escolha Volume da lista de queda inferior e, em seguida, registe o volume do casco e salve o arquivo, procedendo para a próxima imagem. O volume do território de astrócito foi medido em astrócitos que expressavam uma proteína fluorescente vermelha direcionada à membrana. Knockdown da molécula de adesão celular enriquecida por astrócito, hepaCAM, reduz significativamente o volume de território de astrócito.
A análise de mosaico com marcadores duplos foi usada para gerar camundongos onde astrócitos do tipo selvagem expressam uma proteína fluorescente vermelha e os astrócitos hepaCam expressam uma proteína fluorescente verde. Calculou-se a porcentagem de sobreposição de território entre os pares de astrócitos de proteína fluorescente vermelha e verde. Os camundongos com modificação genética de hepaCAM e astrócitos verdes mostraram uma porcentagem significativamente maior de volume de sobreposição de território com seus vizinhos vermelhos do tipo selvagem em comparação com pares de astrócitos do tipo selvagem.
Este resultado demonstra que o hepaCAM é necessário para o volume normal do território de astrócito e astrócito. É fundamental garantir que a célula atenda aos critérios de inclusão. Uma célula incompleta terá um volume de território menor e poderá afetar seus resultados e conclusões gerais.
