Este protocolo descreve as técnicas usadas para produzir o Newcastle Disease Virus para que possa ser administrado com segurança para camundongos e outros animais, como hamsters e ovelhas. O uso da filtragem de fluxo tangencial permite que grandes volumes iniciais sejam processados de forma mais eficiente em comparação com os procedimentos existentes que utilizam apenas processos de centrifugação. Este é um procedimento demorado envolvendo várias etapas complexas, o que significa que o gerenciamento do tempo pode ser um problema.
Recomendo identificar todos os passos potenciais de pausa para que a técnica possa ser dividida adequadamente, minimizando o estresse. Demonstrando este procedimento estará Alex, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Para a purificação do Newcastle Disease Virus ou NDV, primeiro, prime o sistema experimental previamente definido executando 50 mililitros de PBS através dele.
Pare a bomba quando aproximadamente cinco mililitros de PBS forem deixados no tubo. Em seguida, conecte um filtro de profundidade com uma classificação de retenção de um a três micromolars à tubulação. Para desovendar o filtro, remova a segunda tampa do lado epical do filtro de profundidade e comece a executar mais 50 mililitros de PBS através do sistema.
Uma vez que o PBS começa a fluir através da ventilação na parte superior do filtro, feche a porta e continue a fluir PBS através das linhas. Depois disso substitua o vaso de resíduo por um novo vaso de coleta estéril e comece a executar o fluido allantóico através do filtro de profundidade. Em seguida, configure a filtragem de fluxo tangencial ou sistema TFF em uma confirmação aberta e executada conforme descrito no manuscrito.
Quando restam cerca de cinco mililitros de fluido no reservatório, pare a bomba e adicione o fluido allantóico filtrado de profundidade ao reservatório. Em seguida, retome o fluxo da bomba. Para evitar o estalação do vírus, é importante garantir que a pressão do sistema não exceda a força de 10 libras por polegada quadrada.
Para aumentar a ilusão, deve-se usar uma combinação da velocidade da bomba peristáltica e do grampo C. 150 a 100 mililitros de fluido allantóico são deixados no reservatório, pausam a bomba e trocam o buffer adicionando 150 a 200 mililitros de tampão ML. Novamente, pare a bomba quando cinco a 10 mililitros de fluido são deixados no reservatório, em seguida, usando dois grampos C fechar a linha da cintura.
Desacoplar a linha retented alimentando o reservatório e inseri-lo em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, retome o fluxo e pare quando houver poucas gotas de fluido no tanque do reservatório. Em seguida, remova os grampos C das linhas de resíduos e recoloque a linha de alimentação retented ao tanque do reservatório.
Enquanto isso, para se preparar para a ultracentrifugação de gradiente de densidade idixanol, primeiro adicione um tubo de ultra centrífugas de 0,5 mililitros de 40% iodixanol a um tubo ultra centrífugo de parede fina de 13,2 mililitros. Em seguida, prepare a coluna com sucessivas adições de 2,5 mililitros de 20% iodixanol, e 2,5 mililitros de 10% iodixanol. Antes da ultracentrifugação, adicione cuidadosamente seis a 6,5 mililitros da solução de vírus aludindo do sistema TFF à coluna iodixanol sem perturbar o gradiente.
Após a ultracentrifugação, remova os tubos com um par de fórceps estéreis. A banda-alvo deve ser uma grande banda entre os 10 e 20% gradientes. Em seguida, suspenda o tubo sobre o topo de um béquer usando um suporte de réplica.
Depois disso, conecte uma agulha de 1,5 polegadas de calibre 18 a uma seringa de cinco mililitros e, em seguida, puna o lado do tubo ultracentrífuga com a agulha e remova a faixa alvo, estendendo lentamente o êmbolo. Depois de remover iodixanol da solução do vírus como descrito no manuscrito, use uma seringa para injetar cuidadosamente o vírus em um de diálise. Para concentrar a solução do vírus, remova o de diálise do tampão de diálise e coloque-o em um pequeno saco plástico vedado.
Em seguida, adicione um 15 a 25 mililitros de 40% de polietileno glicol ao saco para que o de diálise fique completamente submerso. Após a diálise enxague brevemente o de diálise com PBS. Em seguida, encha uma seringa equipada com uma agulha de 1,5 polegadas com ar, insira a seringa no de diálise e empurre o êmbolo.
Gire o aparelho para remover o vírus sem remover nenhum ar introduzido. Para desalojar o vírus residual aderindo à membrana, massageie cuidadosamente a membrana com dedos enluvados sem danificá-la. Para facilitar o processo de desalojador, remova parte do excesso de ar no de diálise.
Para ensaios de controle de qualidade, primeiro, diluir a solução do vírus 100 vezes adicionando 10 microliters dele a 990 microliters de PBS em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, continue a diluição serial adicionando 100 microliters da diluição anterior a 900 microliters de PBS. Para ensaios de infecção, adicione 20 microliters de cada ilusão a cada poço de uma placa de 96 poços.
Antes de examinar o efeito citopático da proteína de fluorescência verde, ou realizar um ensaio indireto de imunofluorescência, incubar a placa a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por pelo menos 48 horas. Utilizando este protocolo, o NDV altamente purificado foi obtido como demonstrado pela eletroforese de gel de poliacrilamida de sódio das proteínas virais. A infectividade do vírus purificada por este método também foi verificada pela dose de infecção por cultura de tecido de 50% ou ensaio TCID50 feito em 96 placas de poço.
O TCID50 foi determinado a partir do número de poços positivos para cada diluição usando a calculadora Spearman-Karber. O ensaio de infecção revelou a diferença entre os efeitos citopáticos do NDV lentogênico e mesogênico em DF uma células em diferentes condições após 10 e 24 horas de incubação. O ensaio imuno florence também foi eficaz no estudo da infecção das células Vero pelo NDV lentogênico.
Ao priming o sistema experimental, certifique-se de que as linhas são preparadas efetivamente como qualquer hidróxido de sódio residual irá inativar o vírus. Também é importante manter a integridade da membrana, pois comprometer isso prejudicará significativamente a purificação e o rendimento do vírus.
