O Murine Ommaya, que imita o reservatório Ommaya usado clinicamente, permite que os pesquisadores testem uma variedade de terapias direcionadas diretas para metástases cerebrais e doenças leptomeningeal universalmente fatais em um modelo pré-clínico. A vantagem dessa técnica é que os pesquisadores podem fornecer volume de microliter de drogas diretamente no fluido cefalorraquidiano para tratar metástases do sistema nervoso central, contornando a barreira hemoencefálica. Este protocolo de implantação murine ommaya é projetado para pesquisadores ou técnicos que têm experiência em cirurgia estereotática e treinamento de técnica asséptica, que são essenciais para garantir o sucesso deste procedimento.
Demonstrando o procedimento estarão Margie Baldwin e Michelle Danielson, da Comparative Medicine da Universidade do Sul da Flórida, e Vincent Law, pesquisador sênior do laboratório do Dr. Peter Forsyth no Moffitt Cancer Center and Research Institute. Comece injetando o rato subcutânea com um miligrama por quilograma de liberação sustentada de buprenorfina. Depois de anestesiar o rato, prepare-o para a cirurgia.
Corte o local cirúrgico com área de fronteira suficiente para evitar que a pele contamine o local da incisão. Raspe a pele de toda a superfície da cabeça, e prepare a pele usando técnica estéril. Em seguida, saturar o local com antisséptico da pele germicidal, trabalhando do centro do local até a periferia, e deixe-o secar.
Posicione o corpo para garantir que a coluna seja mantida nivelada com a cisterna magna. Ao aplicar ligeiro tração na cauda, coloque a fita na base traseira para fixá-la. Aplique uma cortina estéril ou um material de cortina de plástico estéril apoiado por adesivo para proteger o local cirúrgico da contaminação.
Com o pescoço em plena extensão, execute as pontas da tesoura cirúrgica para baixo com leve pressão através do osso occipital, começando apenas entre o pinnae. Faça uma pequena incisão média de três a cinco milímetros, ligeiramente acima da concavidade palpada. Desenhe cinco microliters da suspensão da célula em uma seringa Hamilton calibre 30.
Use fórceps com ponta de uma a duas milímetros para pressionar suavemente a cisterna magna. Introduza as pontas em posição fechada e abra-as enquanto aplica pressão para baixo na dura. Repita a dissecção contundente até que a membrana dural seja facilmente identificada e os vasos sanguíneos associados sejam visíveis na área exposta.
Enquanto segura os fórceps abertos para retrair a musculatura circundante, introduza uma agulha de 30 medidores não-coring sob a dura para visualizar o bisbilhotão, certificando-se de que a agulha só é introduzida um pouco além do próprio chanfrado. Implante lentamente um êmbolo de seringa e entregue células logo abaixo da dura. Se for observado vazamento no local da injeção, aplique pressão suave com um aplicador de ponta de algodão.
Feche a pele aplicando um clipe de ferida ou uma micro gota de adesivo de pele. Monitore os ratos diariamente após a cirurgia durante a primeira semana. Se um rato parece estar com dor ou angústia, trate-o com uma injeção subcutânea de 10 miligramas por quilograma de carprofeno uma vez a cada 12 a 24 horas por até cinco dias com base em consulta veterinária e diretiva.
Monte o dispositivo de injeção Murine Ommaya usando uma porta de injeção em miniatura de 25 bitola e um disco espaçador de um milímetro. Use um adesivo estéril cianoacrilato para garantir a penetração de aproximadamente 2,5 milímetros da cânula metálica no hemisfério cerebral direito, e prepare a pele de acordo com a técnica estéril. Faça uma pequena incisão cutânea seguida de dissecção contundente dos tecidos subcutâneos subjacentes para expor o crânio.
Seque o crânio usando palitos aplicadores de algodão encharcados de hidrogênio. Faça um orifício de rebarba de 0,9 milímetros no crânio 0,5 milímetros posterior e 1,1 milímetros lateral do bregma para expor a matéria dura. Mova o microdrill de lado e marque suavemente o osso imediatamente ao redor do orifício da rebarba.
Afixe uma porta de injeção no crânio usando um adesivo estéril cianoacrilato e inseri-lo a uma profundidade de aproximadamente 2,5 milímetros. Suturar a incisão usando suturas de nylon não absorvíveis 4-0 em um padrão de ponto interrompido ou sutura de corda de bolsa. Casa pós-cirurgia ratos em gaiolas individuais para recuperação.
Para dosar o mouse, acesse o Murine Ommaya usando um adaptador de injeção de porta e uma seringa Hamilton. Usando fórceps, segure a parte superior da porta de injeção em miniatura e insira suavemente o adaptador do injetor da porta totalmente no septo da porta. Uma vez feita a injeção, desprende o Murine Ommaya do adaptador de injeção de porta com fórceps.
Para visualizar a rota da injeção, 2% Evans Blue foi injetado através do modelo Murine Ommaya. O corante se infiltrou com sucesso nos ventrículos e no cérebro em 15 minutos. Após 30 minutos, o corante tornou-se visível na medula espinhal.
Como prova de conceito, os camundongos BALB/c foram injetados com uma linha de células cancerígenas de mama Her2+TUBO com a luciferase intracisternally, e os Murine Ommayas foram implantados. Aproximadamente uma semana após a injeção, os camundongos começaram a desenvolver LMD. Estes camundongos foram tratados uma vez por semana por até quatro semanas com imunoterapia de anticorpos Her2, seja através de terapia sistêmica via injeção intraperitoneal ou intratecally através da Murine Ommaya.
Enquanto camundongos não tratados morreram no dia 19, todos os camundongos que recuperaram a terapia intratecal através do Murine Ommaya sobreviveram. Na quarta semana, observou-se uma regressão completa dos tumores. Em comparação com camundongos tratados com terapia sistêmica, os camundongos que receberam terapia intratecal tiveram uma sobrevida geral muito maior.
Ao tentar este procedimento, é importante que o crânio esteja seco antes de colocar o Murine Ommaya. Use uma pequena quantidade de cola e posicione a Murine Ommaya por cerca de 10 segundos para aderir ao crânio. Com essa técnica, os pesquisadores podem explorar uma ampla gama de medicamentos contra o câncer em modelos de camundongos que são clinicamente relevantes para projetar estratégias terapêuticas racionais para pacientes com metástase do sistema nervoso central.
