Neste protocolo, demonstramos um procedimento eficaz para a fabricação de microesferas porosas altamente abertas à base de PLGA, que oferecem várias vantagens, como conveniência de células de embalagem, retenção celular aprimorada e invasividade mínima. As microesferas porosas monodispersas à base de PLGA resultantes possuíam tamanhos de partículas de aproximadamente 400 micrômetros e poros abertos de aproximadamente 50 micrômetros com janelas de interconexão para melhorar a eficácia da retenção celular. Esses microportadores minimamente invasivos podem suportar uma plataforma de um intrincado modelo de tumor 3D para triagem de drogas e ferramentas fáceis para construir microtecidos carregados de células para regeneração tecidual.
Essa abordagem é bastante fácil, pois o dispositivo microfluídico pode ser montado a partir de tubos de cloreto de polivinila, um capilar de vidro e uma agulha. Demonstrando o procedimento estará Sheng-Chang Luo, um estudante de doutorado no laboratório. Comece construindo um gerador microfluídico de co-fluxo usando um capilar de vidro, tubos de cloreto de polivinila e uma agulha de dosagem de calibre 26.
Em seguida, conecte o capilar de vidro ao final do tubo de cloreto de polivinila e perfure a conexão entre os dois com uma agulha. Para a geração de gotículas, coloque a outra extremidade do tubo de cloreto de polivinila na fase contínua e cure com a cola ultravioleta para selar as lacunas na articulação. Agora pegue uma seringa de 50 mililitros para carregar a fase contínua e uma seringa de cinco mililitros para formação de emulsão.
Em seguida, defina as taxas de fluxo da fase contínua em dois mililitros por minuto e as fases de dispersão em 0,08 mililitros por minuto. Coloque um copo de 500 mililitros em um banho de gelo e encha-o com uma solução aquosa de álcool polivinílico pré-resfriada. Para preparar a emulsão, decante imediatamente a solução aquosa de gelatina na solução DCM de PLGA e emulsifique usando o dispositivo ultra-sônico.
Em seguida, ajuste a potência ultra-sônica para 400 watts e o tempo total de processamento para 90 segundos e altere constantemente a posição da sonda manualmente. Estabilizar a emulsão resultante para sucção de seringas e geração de gotículas em aproximadamente 20 minutos. Após o tratamento ultra-sônico, carregue rapidamente a emulsão preparada na seringa de cinco mililitros na plataforma microfluídica e introduza a emulsão instável de óleo de água no dispositivo microfluídico como a fase descontínua.
Simultaneamente, use a solução aquosa de álcool polivinílico como fase contínua. Depois de injetar porções adequadas da emulsão no dispositivo microfluídico, colete a microesfera que contém a emulsão no fundo do copo coletor e coloque a amostra a quatro graus Celsius durante a noite para estabilização adicional. Normalize as microesferas armazenadas à temperatura ambiente e elimine o DCM residual agitando com uma haste de vidro durante uma hora a 60 RPM.
Em seguida, decante cuidadosamente a fase de coleta em um copo de 500 mililitros e lave o álcool polivinílico residual da superfície das microesferas porosas com água deionizada três vezes. Dissolva a gelatina envolta na espinha dorsal do PLGA colocando as microesferas do PLGA no banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, remova a gelatina residual enxaguando as microesferas resultantes com a água deionizada duas vezes e pré-resfrie para liofilização a menos 80 graus Celsius por 24 horas.
As microesferas porosas altamente abertas baseadas em PLGA exibiam tamanhos de 350 a 500 micrômetros com um poro de tamanho arbitrário de 10 a 100 micrômetros e janelas interconectadas, o que poderia facilitar a alta eficiência no transporte de resíduos metabólicos de oxigênio. As células-tronco mesenquimais da medula óssea cultivadas dentro das microesferas porosas altamente abertas à base de PLGA aderiram aos andaimes em um dia, representando extensas capacidades de adesão e migração das células. A coloração de iodeto de cálcio-AM e propídio mostrou que as células estão vivas e distribuídas uniformemente.
É essencial definir a potência ultra-sônica e a posição da sonda. A produção reprodutível de microesferas porosas altamente abertas à base de PLGA abrirá o caminho para a construção de gráficos de prateleira para induzir a regeneração ou triagem de medicamentos.
