NGF entregue ao cérebro é desafiador. Aqui apresentamos um novo tipo de portador que permite uma liberação segura e prolongada da proteína bioativa. Esta técnica permite um carregamento simples e eficiente de NGF em portadores de silício porosos.
É realizado à temperatura ambiente e sem o uso de solventes orgânicos fortes. Como o design do portador de silício poroso é incapaz, os transportadores podem servir como implantes de reservatório NGF para uma liberação de longo prazo, mas também podem ser modificados para transportar outros fatores e medicamentos. Para engenheiros e químicos, o processo de fabricação pode ser mais fácil de executar.
Enquanto para cientistas e clínicos da vida, os procedimentos de cultura celular devem ser relativamente simples de se reproduzir. Comece montando um wafer de silício de um ponto cinco por um ponto de cinco centímetros com uma resistividade bem caracterizada em uma célula de gravação de ethaline politetrafluro usando uma tira de papel alumínio como um contato de costas e um anel o para selar a célula. O tecido é reresistível para o uso de wafers de silício com valores de resistividade semelhantes a cada vez.
Eletroquimicamente etch a amostra de silício em uma solução de três a um de ácido fluorídrico akleus e etanol por 20 segundos a uma densidade de corrente constante de 250 milamps por centímetro quadrado. Em seguida, enxágue a superfície do filme de silício poroso resultante com etanol três vezes antes de secar sob um fluxo de nitrogênio. Quando a amostra estiver seca, oxidar termicamente a amostra de silício poroso recém-gravada no forno do tubo a 800 graus Celsius por uma hora no ar ambiente para formar um andaime de silício poroso oxidado.
Quando a amostra tiver esfriado, use uma serra de dicing para cortá-la em uma amostra de oito por oito milímetros. Para carregar as amostras com NGF, dispense 52 microliters de solução de carregamento NGF recém-preparada em cima de cada amostra e incubar as amostras por duas horas à temperatura ambiente em um prato coberto sob condições de alta umidade. Após duas horas, colete a solução em cima das amostras e diluir a solução de carregamento NGF e as amostras de solução de pós-carregamento coletadas para a faixa de concentração apropriada para o kit iliza.
Quando todas as amostras tiverem sido diluídas, adicione 100 microlitadores das amostras diluídas em amostras de curva de calibração a cada poço de um anticorpo de captura NGF revestido 96 placas bem iliza para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. No final da incubação, lave a placa quatro vezes e adicione cem microlitadores de um micrograma por mililitro de anticorpo de detecção biotentilado a cada poço para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. Depois de quatro lavagens, como demonstrado adicione 100 microliters de Peroxidace Avidin-Horseradish a cada poço para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente seguido por quatro lavagens em tampão de lavagem como demonstrado.
Após a última lavagem, adicione 100 microliters de solução de substrato a cada poço para uma incubação de desenvolvimento de cores de 25 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, use um leitor de microplaca para medir a absorvância em 405 nanômetros com o conjunto de correção de comprimento de onda em 650 nanômetros e determinar a concentração de NGF tanto na solução de carregamento quanto na solução de pós-carregamento coletada com base na curva de calibração. Para a versão In Vitro NGF, incubar os porta-silícios porosos oxidados carregados NGF em dois mililitros de zero ponto zero um molar PBS complementado com um por cento de sero de boyvine albaman em zero ponto zero dois por cento de azida de sódio a 37 graus Celsius e 100 rotações por minuto de adjatação orbital.
Colete a solução a cada dois dias substituindo-a por dois mililitros de PBS frescos após cada aspiração. Em seguida, congele as amostras de liberação coletadas em nitrogênio líquido para menos 20 graus Celsius de armazenamento até a análise ngf por iliza como apenas demonstrado. Para gerar um feo sitoma 12 ou PC 12 diferenciado, a cultura celular, coletar a suspensão celular por sentripugation e suspender as células em cinco mililitros de meio de crescimento básico fresco.
Após uma segunda sentribução, suspenda o paladar em três mililitros de meio básico de crescimento e use uma seringa de calibre 23 para aspirar as células 10 vezes para separar qualquer aglomerado celular. Após a contagem, a semente uma vez 10 a 4 células por centímetro quadrado área de trabalho em um colígeno tipo um placas revestidas na presença de meio de diferenciação. Coloque as placas na incubadora.
Após 24 horas a 37 graus Celsius adicione o novo porta-silício poroso calão murine beta NGF ou NGF carregado a cada placa e devolva as placas à incubadora. Para avaliar a viabilidade celular, incubar as culturas com 10% de uma solução indicadora de viabilidade adequada em pontos de tempo representativos por cinco horas a 37 graus Celsius e medir a absorvância em um espectetômetro a 490 nanômetros com a correção do comprimento da onda fixada em 630 nanômetros. Para avaliar a diferenciação celular PC 12 na presença de portadores de silício poroso carregados NGF, semeou as células PC 12 em 12 placas revestidas de colágeno baixo por 24 horas em uma incubadora de cultura celular e introduzir as amostras in vitro previamente obtidas para os poços experimentais apropriados.
Após uma incubação de 24 horas, imagem as células por microscopia leve e contagem manual do número de células com alkronuritos em cada poço. Para análise morfométrica das células diferenciadas do PC 12, adquira imagens de fase das células cultivadas até três dias após o tratamento com NGF e abra os arquivos no neurônio J.Converta o arquivo de imagem em um formato de oito bits e use a barra de escala de imagem para medir a razão pixel-micrômetro. Use a análise e a escala definida para definir a escala e medir o comprimento de cada neurite.
Em seguida, conte manualmente o número de pontos de ramificação e o número de nouritos originários de cada soma celular. Imagens de microscopia eletrônica de alta resolução do filme de silício poroso oxidado resultante são mostradas. Um micrografo de visão superior do filme revela sua natureza altamente porosa com poros de aproximadamente 40 nanômetros de diâmetro.
Um micrografo transversal de um filme rachado revela uma espessura porosa de camada de dois pontos nove micrômetros que é caracterizada pela interconexão de poros cilíndricos. Uma liberação sustentada de NGF sem efeito de estouro é alcançada por um período de um mês com uma versão NGF mais rápida durante a primeira semana em comparação com uma taxa de lançamento muito mais lenta nos últimos dias do período de lançamento. O tratamento com portadores de silício poroso carregados de NGF induz a formação de neurites em redes neuronais ramificadas características nas culturas celulares PC 12.
Note-se que mesmo após 26 dias, o NGF liberado induz diferenciação celular acima de 50% indicando que a armadilha de NGF dentro do hospedeiro poroso preserva a atividade biológica da proteína por um período de cerca de um mês. A análise morfométrica das populações de células tratadas porosas de silício carregadas de NGF nos dias um e três revela que as células PC 12 tratadas com silício poroso carregado de NGF apresentam valores morfométricos semelhantes aos observados nas culturas de tratamento controlados para todos os três parâmetros testados. Seguir e cumprir adequadamente as etapas apresentadas lhe proporcionará um sistema de entrega de NGF vantajoso capaz de sustentar a sobrevivência e diferenciação das células neuronais.
Atualmente estamos investigando o uso de portadores de silício poroso NGF como implantes de liberação de longo prazo no cérebro para estudar seu efeito protetor normal e conhecer doenças degenerativas como a doença de Alzheimer. Após este procedimento, o efeito do NGF carregado portadores de silício poroso em um crescimento normal de células gangrenas de madeira dosal também pode ser estudado. O silício poroso é um material nano promissor que pode ser utilizado para uma ampla gama de aplicações.
Além do apresentado aqui, incluindo sensores biológicos ou químicos, diagnósticos e imagens. Para descartar qualquer toxicidade potencial dos portadores de silício poroso, em direção à sua linha celular, certifique-se de realizar ensaios de severidade e esterilizar suas amostras de silício porosos.
